GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒

本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10~3拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系。结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。     

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒—人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型。优化多重反应体系中针对5’UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度。结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA。该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查。     

建立新型的常见腹泻相关病毒的多重检测方法

利用GenomeLab(tm)GeXP遗传分析系统建立一种同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GI、GII型、札如病毒、肠道腺病毒、星状病毒、人博卡病毒II型7种常见腹泻相关病毒的方法。对反应条件进行优化后,非同日三次重复实验表明至少在104拷贝/μL水平可同时特异地检测出7种病毒,对Enterovirus71、Human Parechovirus、Picobir-navirusII阳性标本无交叉反应。本研究初步建立了一种高通量、快速的常见腹泻相关病毒的检测方法,为腹泻病原的分子诊断提供了新的方法。     

同时鉴别6种鸡病毒性呼吸道病GeXP检测方法的建立

为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒、混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性,以不同拷贝数的克隆质粒来检测GeXP方法的灵敏度。检测34份临床阳性样品,进一步验证该法的可靠性。结果显示,在7对引物同时存在的GeXP反应体系中,可特异性地扩增出相关6种病毒目的片段,并可在102拷贝/μL水平同时特异地检测出鸡6种病毒性呼吸道传染病,GeXP方法检测34份临床阳性样品结果与病毒分离一致。本研究建立的GeXP方法不仅可高通量检测6种病原体,而且具有特异性强和灵敏度高的特点,适用于临床样品混合感染的快速鉴别诊断,对这6种发病特征及临床症状相似的鸡病毒性呼吸道病的有效防控有很高的实际应用价值。     

肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立针对肠道病毒(enterovirus,EV)、乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和腮腺炎病毒(mumps virus,MUV)的多重RT-PCR检测方法,分别选择肠道病毒的5′UTR基因、乙脑病毒的E基因和腮腺炎病毒M基因设计3对引物,建立同时检测肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR方法.以中国地区流行的与脑炎相关的麻疹病毒和风疹病毒cDNA为模板验证该检测方法的特异性,同时以梯度稀释的不同滴度的脊髓灰质炎病毒、乙脑病毒、腮腺炎病毒评估该检测方法的检出限.所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒的152 bp、429 bp和274 bp基因片段,基因序列分别与脊髓灰质炎病毒Sabin 1型5′UTR基因片段、乙型脑炎病毒SA-14-14-2株E基因片段及腮腺炎病毒S79基因片段序列一致;检出限分别达到78.1 CCID50/mL、312.5 PFU/mL、156.2 CCID50/mL;而对麻疹病毒和风疹病毒的扩增均为阴性.所建立的多重RT-PCR特异性和检出限良好,可用于上述3种脑炎病毒的快速检测.     

菊花5种病毒及类病毒多重RT-PCR检测方法的建立

菊花是世界最重要的园艺作物之一,兼具有茶用、药用、食用及观赏等多种经济价值。我国是栽培菊花的起源地,也是主要种植生产区。病毒病害是菊花生产过程中最主要病害,目前已知的菊花病毒及类病毒有20多种,对菊花产业危害巨大。建立快速、高效的检测方法是病害防控的必要条件。前期调查显示番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus,TAV）、菊花B病毒（Chrysanthemum virus B,CVB）、菊花矮化类病毒（Chrysanthemum stunt viroid,CSVd）和菊花褪绿斑驳类病毒（Chrysanthemum chlorotic mottle viroid,CChMVd）是北京地区菊花中主要病毒及类病毒种类。自NCBI数据库下载以上病毒/类病毒的基因序列,利用不同病毒保守区域,设计开发出特异性引物,建立了5种病毒/类病毒同时检测的多重RT-PCR体系;并对反应体系中引物对的含量配比、退火温度、模板含量等因子进行了优化。试验结果显示,TSWV、TAV、CVB、CChMVd、...     

五种主要上呼吸道病毒多重RT-PCR 检测方法的建立

目的:建立甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、B型(RSV-A、RSV-B)和腺病毒(ADV)五种主要上呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法。方法:利用Primer premier5.0分别针对甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的PB1基因、RSV-A和RSV-B的F基因及ADV的hexon基因设计五对特异性引物,对Mg2+、dNTP、引物浓度及退火温度等进行优化,建立同时检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV的多重RT-PCR方法,并验证该检测方法的灵敏性。结果:所建立的五种病毒的多重RT-PCR方法可以同时或者分别扩增甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B及ADV的141bp、635bp、525bp、377b和283bp基因片段,敏感度分别达到770PFU/ml、800PFU/ml、680PFU/ml、970PFU/ml和850PFU/ml,且五种病毒间无交叉反应。结论:所建立的多重RT-PCR方法可以迅速准确地检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV,为五种病毒的检测提供了一种方便易行的方法。     

委内瑞拉马脑炎病毒一步法荧光定量RT-PCR方法的建立

委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis,VEE)是由委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)复合物引起的一种人兽共患病。我国目前尚无该病,因此建立一种快速准确的检测方法对预防和控制该病至关重要。本研究通过分析委内瑞拉马脑炎病毒nsp1基因序列的保守性,设计了一对能检测VEEV复合物所有亚型毒株的特异性引物和Taqman探针。通过反应体系和反应条件优化,建立了检测委内瑞拉马脑炎病毒复合物的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。该方法检测VEEV经体外转录获得的RNA,检测的灵敏度达3.27×102拷贝/μL。以该方法检测与VEEV同属的东方马脑炎病毒(EEEV)和西方马脑炎病毒(WEEV)nsp1基因相同区段的RNA以及同属的基孔肯雅病毒(CHIKV),结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法将为可能在我国出现的委内瑞拉马脑炎的侦检提供有效技术手段。     

猪乙型脑炎的快速诊断方法的建立与应用

西北农林科技大学动物科技学院唐青海，安立国与湖北省农科院牧医研究所乔宪凤，周荆荣等根据乙脑病毒基因组3’末端保守压设计了一对特异性引物，建立了乙脑病毒不同株的RT-PCR诊断技术。     

Simultaneous detection of three arboviruses using a triplex RT-PCR enzyme hybridization assay

Arboviruses represent a serious problem to public health and agriculture worldwide.Fast,accurate identification of the viral agents of arbovirus-associated disease is essential for epidemiological surv...     

马铃薯病毒一步法多重RT-PCR检测技术的构建

根据马铃薯病毒PVX、PVY、PVA、PLRV的CP基因序列设计4对特异性引物,通过对试剂浓度和反应条件进行优化,建立了能够同步检测PVX、PVY、PVA、PLRV的一步法多重RT-PCR检测方法。该方法对PVX、PVY、PVA、PLRV扩增出的靶带大小分别为732、422、132和336 bp,凝胶电泳易辨别区分。病毒RNA最低检测限度为7.8 pg/μL,对PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的扩增为阴性。研究结果表明,该方法特异、灵敏,比两步法多重RT-PCR检测更加快速、简便,提高了检测效率,降低检测成本,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

Simultaneous detection of eight immunosuppressive chicken viruses using a GeXP analyser-based multiplex PCR assay

Background

Immunosuppressive viruses are frequently found as co-infections in the chicken industry, potentially causing serious economic losses. Because traditional molecular biology methods have limited detection ability, a rapid, high-throughput method for the differential diagnosis of these viruses is needed. The objective of this study is to develop a GenomeLab Gene Expression Profiler Analyser-based multiplex PCR method (GeXP-multiplex PCR) for simultaneous detection of eight immunosuppressive chicken viruses.

Results

Using chimeric primers, eight such viruses, including Marek's disease virus (MDV), three subgroups of avian leucosis virus (ALV-A/B/J), reticuloendotheliosis virus (REV), infectious bursal disease virus (IBDV), chicken infectious anaemia virus (CIAV) and avian reovirus (ARV), were amplified and identified by their respective amplicon sizes. The specificity and sensitivity of the optimised GeXP-multiplex PCR assay were evaluated, and the data demonstrated that this technique could selectively amplify these eight viruses at a sensitivity of 100 copies/20 μl when all eight viruses were present. Among 300 examined clinical specimens, 190 were found to be positive for immunosuppressive viruses according to this novel assay.

Conclusion

The GeXP-multiplex PCR assay is a high-throughput, sensitive and specific method for the detection of eight immunosuppressive viruses and can be used for differential diagnosis and molecular epidemiological surveys.

     

基于免疫磁分离的三重荧光定量PCR检测食品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌

【目的】开发一种同时对食品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌快速、灵敏、准确的检测方法。【方法】利用特异性免疫磁球,在37°C条件下从250 m L猪肉增菌液体系中边富集边循环捕获目标菌。快速提取DNA后,利用特异性的引物与探针,对3种食源性致病菌进行三重荧光定量PCR检测。【结果】针对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别达到2.0、6.8和9.6 CFU/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度达到99.2%、100%及99.5%。对151份实际样品进行检测,与国标(GB/T 4789.4-2010、GB 4789.5-2012和GB/T4789.10-2010)方法的检测结果相比,金黄色葡萄球菌有一例阴性偏差。【结论】开发的基于免疫磁分离的三重荧光定量PCR方法,能够在8 h内完成对食品中3种致病菌检测,并且灵敏度高、特异性好、检测准确,可以作为快速应对此类食品安全突发事件的检测手段。     

Development of multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of four viruses infecting apple (Malus domestica)

The major viruses infecting apple cultivars throughout the world including India are apple mosaic virus (ApMV), apple stem pitting virus (ASPV), apple stem grooving virus (ASGV), apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), and recently, a new virus, apple necrotic mosaic virus (ApNMV), was reported from mosaic-infected apple cultivars in India. The aim of this study was to detect the ApNMV virus along with the other three viruses (ApMV, ASPV and ASGV) simultaneously by multiplex RT-PCR. Four primer-pair-produced amplicons of 670, 550, 350 and 210 bp corresponding to ApNMV, ApMV, ASPV and ASGV, respectively, were found to be specific for these viruses when tested individually. The annealing temperature (55°C), primer concentration (0·8 µl) and other components of the master mix were standardized for the development of one-step m-RT-PCR assay. The m-RT-PCR protocol developed was further validated with 30 samples from seven symptomatic or asymptomatic apple cultivars, which revealed the presence of more than one virus in these cultivars. Most of the viruses were found to be present either alone or in mixed infection; however, ASPV was more common in tested cultivars. An easy, cost-effective and rapid multiplex RT-RCR protocol was developed to detect the four viruses, which infect apple plants either in individually or together in the field. This assay will help in the surveying and indexing of apple germplasm and the distribution of all four viruses in the apple growing regions of India.