米曲霉产氨基酰化酶最佳活力条件的研究

通过在不同的反应时间,反应温度,缓冲液种类及pH条件下测定氨基酰化酶的活力,得出氨基酰化酶的最佳活力条件。试验结果表明,氨基酰化酶在反应温度为37℃、磷酸缓冲液pH为7.5、与底物反应30 m in时,活力最高。     

鸟氨酸氨基甲酰移换酶的研究 Ⅰ.鸟氨酸氨基甲酰移换酶活力的测定

(1)本报告提供根据瓜氨酸砷酸解产物的鸟氨酸及氨的生成量作为测定鸟氨酸氨基甲酰移换酶(OCT)活力的两种方法。(2)根据氨生成量的直接纳氏比色法是最快速简捷的方法,重复性及回收率均很高,所需设备亦较简单;根据鸟氨酸生成量的纸上层析法,能测极微量的样品,应用两种方法,均获得相同的结果。(3)对OCT的最适温度、pH及酶、底物浓度等影响作了研究。(4)OCT对热有高度的稳定性。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究 Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH为7.5(0.1M磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。     

醛縮酶的研究——I.底物对醛縮酶被胰蛋白酶消化时的保护作用

(一)天然醛縮酶受胰蛋白酶消化迅速失活,但底物的存在有明显的保护作用。在实驗的条件下,如有底物的存在,醛縮酶被胰蛋白酶消化20分钟时就釋放出三个肽段(舍27个氨基酸殘基)保留約原活力的60％,而无底物保护的酶則完全失活。 (二)在底物存在下,醛縮酶受胰蛋白酶消化得到的殘余酶蛋白基本上是均一的,具有和天然醛縮酶若干相似的性质。 (三)在底物保护下,醛縮酶受胰蛋白酶消化釋放肽的位置可能在醛縮酶B鏈的N端部分。 (四)底物的可能保护机制是FDP与酶形成相对稳定的酶-底物絡合物,FDP的6-磷酸部分与酶蛋白肽鏈C端酪氨酸或其附近的某个基团相連,二羥丙酮磷酸部分的磷酸則与活性中心賴氨酸附近的氨基酸相結合,使賴氨酸的ε-氨基处于易与底物的酮基結合形成Schiff碱的地位。 (五)磷酸緩冲液也具有对抗胰蛋白酶消化醛縮酶的保护作用,但其机制可能与FDP不同。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH 为7.5(0.1M 磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m 值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m 值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。     

氨基酰化酶中金属锌离子的功能作用

 氨基酰化酶是含锌金属酶。该酶每摩尔蛋白中含2摩尔Zn(Ⅱ)离子。金属鳌合剂与酶作用,通过竞争螯合Zn(Ⅱ)离子使酶活力下降。残余活力与残留金属含量呈正相关。竞争螯合的结果,生成不含金属的脱辅基酶蛋白,并导致酶活力的丧失。脱辅基酶由于加入Zn(Ⅱ)离子而恢复其活力。实验表明金属锌离子是氨基酰化酶催化活力所必需。与Zn(Ⅱ)离子相似,Co(Ⅱ)离子也可与脱辅基酶相结合并使之复活。 在190—240nm区域内对比了天然酶、脱辅基酶蛋白与Co(Ⅱ)置换氨基酰化酶的圆二色谱。远紫外圆二色谱表明,与天然酶相比,在脱辅基酶中由于金属离子的丧失导致主链构象发生变化,其中α螺旋增加约7％。因而锌离子(钴离子)对蛋白主链的反应最适构象有一定的稳定作用。脱辅基酶与Co(Ⅱ)离子结合,酶的主链构象恢复至与天然酶几近相同。可认为这是促使酶复活的内在因素。     

利用6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在低温条件下获得酶-底物复合物实际结构的方法

利用“酶晶体低温抑活底物固定”方法,在?20 ℃条件下,将6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (BglA) 晶体与底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸 (pNPβG6P) 进行浸泡试验,通过X射线进行衍射数据收集并处理,获得了完整的底物电子密度图。研究结果表明,在不突变酶中关键基团使酶失活,以及不选用底物类似物替代原有底物的情况下,通过上述方法,可以获得酶与底物复合物的实际结构。该研究结果可为今后低温酶学及复合物中间态的进一步研究提供帮助。     

甘油醛-3-磷酸脫氫酶—还原輔酶 Ⅰ絡合物的光照分解产物NADH-X′

Krebs等发现在pH6左右,甘油醛-3-磷酸脱氢酶能催化NADH转变成一个新的衍生物NADH-X。NADH-X的吸收光谱与NADH的酸分解产物相似,吸收高峰在265mμ,在340mμ没有光吸收,290mμ—300mμ附近的光吸收此NADH大。Hilvers等报告当用甘油醛作底物时,在甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化NAD~+还原的反应初期生成一个新的衍生物“340 mμ化合物”,此化合物在340 mμ有吸收高峰,但此化合物显然不是NADH,它在反应过程中能逐渐转变成NADH。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

小鼠再生肝胞浆磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶的纯化和性质研究

以~(32)P(Tyr)-Poly Glu,Tyr(4:1)为底物,用于研究小鼠再生肝胞浆磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)的分离纯化和性质。再生肝胞浆经60％饱和度硫酸铵盐析,二次DEAE纤维素层析,Sephadex G-200柱层析和Poly Glu,Tyr-Sepha-rose 4B亲和层析后,得到的PTPP分子量为67000,纯度提高1123倍,活性回收率为28％,对~(32)P(Tyr)-Poly Glu,Tyr有很高的活力,对~(32)P(Ser/Thr)-Casein(酪蛋白)和PNPP(对硝基苯酚磷酸盐)没有作用,其最适pH为6.8～7.1,对热不稳定。EDTA对酶有激活作用,Zn~(2+)、PNPP、P-Tyr、多胺化合物、焦磷酸根、钼酸根、柠檬酸根对酶有明显的抑制作用。酶对Na_3VO_4不敏感。碱性蛋白质组蛋白、鱼精蛋白对酶活力有抑制作用,酸性蛋白质酪蛋白和酸性多糖物质肝素对酶活力有激活作用,且后者能减弱前者的抑制作用。     

日本血吸虫酚酶的研究

日本血吸虫成虫取自人工感染的豚鼠,磨成匀浆后用Warburg呼吸仪測定其酚酶活力。在pH6.8时,对所試4种酚类均有显著的氧化作用,耗氧量以对甲酚为最強,其次为3,4-二羟苯丙氨酸和酪氨酸,邻苯二酚最弱。酶作用后反应液呈灰黑色(3,4-二徑苯丙氨酸,酪氨酸)或赭紅色(对甲酚,邻苯二酚),氧耗越強,色泽越深。以酪氨酸作为底物在pH8.0,最后浓度为4mM时酶活力已接近最高峯;在所試的pH范围(6.5—8.8)內,酶活力随着pH的上升而增高,在pH 8.0—8.8时活力无大差別。肝片吸虫中亦存在着酚酶,但对上述四种底物的相对活力与血吸虫不同,对邻苯二酚和对甲酚的活力远較3,4-二羟苯丙氨酸和酪氨酸为高。血吸虫的酚酶仅存在于雌虫中,雄虫匀浆无此酶作用。治疗血吸虫病的有效药物酒石酸銻鉀对血吸虫的酚酶有显著的抑制作用,最后浓度为10~(-4)M时,酶活力被抑制約60%。以20毫克/公斤体重的酒石酸銻鉀注射感染血吸虫的豚鼠,1小时后解剖取得血吸虫,其酚酶活力較不注射对照低40—70%。由于酚酶在吸虫产卵功能中的重要性,这种抑制作用亦可部分地解释酒石酸銻鉀的作用机制。     

对异硫氰基苯磺酰乙基纤维素的制备及其与碱性磷酸单酯酶的键合

以ABSE-纤维素为原料,用硫光气的二氧六环溶液处理,使氨基转变为异硫氰基,然后与碱性磷酸单酯酶键合。反应最适pH为7.2,不溶酶的相对活力为70%左右,以潮湿状态保存于15℃,45天内活力不变。与对-重氮基苯磺酰乙基纤维素为载体作比较,从键合酶量、相对活力来看均无显著区别。用葡聚糖凝胶G200作支持物,以相同的方法制成含异硫氰基的载体,与碱性磷酸单酯酶键合后,键合酶量和相对活力均与对-异硫氰基苯磺酰乙基纤维素-碱性磷酸单酯酶相同。     

底物对变性酶的修复作用

 兎肌肌酸激酶被LDS变性后,底物能够诱导变性酶使其活力和构象得到部分恢复。变性程度不同的酶,构象和活力的恢复程度也不同:低浓度LDS变性酶,恢复程度较高;反之亦然。活力的恢复与构象的恢复两者呈对应关系。底物修复作用的pH以8.2为好。底物修复作用受其它蛋白质(例如BSA)存在的影响。等速电泳结果表明,BSA能竞争性结合LDS-酶复合物的LDS,使酶成为游离酶。变性酶先与BSA保温再加底物所得的活力恢复,大约是变性酶与含BSA的底物保温所得活力的10倍。这一结果似表明LDS变性酶仍能结合底物;被结合的底物还能使变性酶的构象发生变化。     

功能基化聚丙烯酸甲脂固定化氨基酰化酶的研究

以功能基化聚丙烯酸甲酯为载体制备固定化氨基酰化酶时,载体制备时的交联度,致孔剂用量和混合致孔剂比例均会影峋酶的固定化效率。结果表明25％交联度和loo％致孔剂用量制备的载体最佳。用此载体固定化氨基酰化酶可提高酶对高底物浓度、离子强度、温度、pH、有机溶剂和蛋白质变性剂的耐受能力。用固定化酶柱式反应器连续拆分N－乙酰基－DL－苯丙氨酸,使用一个月仍可保留90％的酶活力。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅱ.酶蛋白中巯基,咪唑基与酶活力的关系

(1)酰化酶能被各种巯基試剂所抑制,其中以PCMB的抑制最为明显,在所有的抑制情况下,都保留有一定的剩余酶活力。巯基乙酸能完全解除PCMB的抑制,恢复程度随所加的浓度而定,当巯基乙酸过量子抑制剂150倍时,酶活力反而高于原始活力20%,若浓度再高,酶活力又重新下降。(2)酰化酶經光氧化后活力就迅速丧失,但加对色氨酸殘基专一的試剂N-溴代琥珀酰亚胺并不影响酶的活力。溴代乙酸在較高浓度下亦能抑制酶的活力,抑制程度在作用pH为5左右时較为明显。(3)pH不影响酰化酶与底物結合的米氏常数K_M,而影响最大反应速度V。从pH对V影响的作图中求出活性基团的pK值为5.9和8.6,分別相当于酶蛋白中組氨酸和半胱氨酸的解离常数。(4)从实驗結果中推測,組氨酸和半胱氨酸是酰化酶的必需基团,它們可能与酶中金属离子以配位价的形式結合而共同构成一活性中心,在酶催化反应吋底物先通过金属离子与酶相結合,然后再进一步被催化。     

植物细胞磷酸脂酶定位技术

磷酸脂酶是水解磷酸与碳之间的键的一种专一性酶。按照它们活性最适宜的pH值分为碱性(pH9.4),酸性(pH5.0)和中性(pH6.5)三种。酸性磷酸酶的定位一般用Gomori的方法;碱性磷酸酶定位的方法在植物上还很少见报道,近年来国际上多用     

木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶的研究——ⅥⅠ.无花果蛋白酶对不同底物的作用

观察无花果蛋白酶对一些合成底物作用的结果,说明酶的专一性和木瓜蛋白酶相似。它的特点是在pH7.4对白-NH_2的作用速度此对Bz-精-NH_2水解速度还快,并且在一定条件下只有白-NH_2的聚合反应而无供体的水解。酶作用于白-NH_2及Bz-精-NH_2共同存在时的反应速度也和木瓜蛋白酶相似,为在相同条件下分别作用于二者的速度之和。但从对氯汞苯甲酸和溴代乙酸的抑制看来,这两种活力是由同一酶所催化,可能酶对于二种反应的活性中心不完全相同。     

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的酶学性质

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）是AROM多功能酶的活性之一.该酶催化莽草酸磷酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）产生5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸和无机磷酸的可逆反应,受除草剂草甘膦（N-（膦羧甲基）甘氨酸）抑制.纯化了核盘菌AROM蛋白并对EPSP合酶进行了酶学特征研究.结果显示,该酶反应的最适pH值为7.2,最适温度为30℃.热失活反应活化能是69.62 kJ/mol.底物S3P和PEP浓度分别高于1 mmol/L和2 mmol/L时,对EPSP合酶反应产生抑制作用.用双底物反应恒态动力学Dalziel方程求得的Km(PEP)为140.98 μmol/L,K _m(S3P)为139.58 μmol/L.酶动力学模型遵循顺序反应机制.草甘膦是该酶反应底物PEP的竞争性抑制剂（Ki为0.32 μmol/L）和S3P的非竞争性抑制剂.正向反应受K⁺激活.当［K⁺］增加时,K _m(PEP)随之降低,Km(S3P)不规律变化,而K _i(PEP)随［K⁺］增加而提高.     

截流荧光法研究米曲霉氨基酰化酶的快速胍变性动力学

 用荧光光谱法、截流荧光法和酶活力测定法研究了在盐酸胍溶液中米曲霉氨基酰化酶变性动力学。我们发现在4.8mol/L盐酸胍溶液作用下(0.05mol/L磷酸缓冲溶液,pH7.4,25℃),氨基酰化酶二聚体解离成单亚基过程是一个十分快速的过程,反应速率常数k为3361l/s,即约需3ms时间完成;而单亚基分子的构象变化需要约20min方能到达平衡态,这是一个逐渐变化的缓慢过程。酶分子在胍作用下的失活现象同酶分子的结构变化紧密相关,在胍浓度大于4mol/L时酶完全失活。在高浓度盐酸胍下酶失活主要是因为酶二聚体迅速解离成单亚基的过程和单亚基构象逐渐变化的缓慢过程。双亚基解离常数大小标志着酶分子亚基间作用力的强弱。     

山梨醇脱氢酶性质研究

目的:山梨醇脱氢酶具有不完全氧化多种羟基化合物的特性,在工业中已广泛应用。该文研究该酶的酶学性质。方法:利用单因素实验对山梨醇脱氢酶的储藏稳定性和操作稳定性、反应液的pH和反应温度对酶活力的影响进行了研究,并进行了反应动力学研究。结果:反应液的pH值为5.5、反应温度为28℃时,酶活力最高;单批次反应过程中,酶基本没有失活。底物耗尽时,连续进行两次补加相同量的底物,酶活力有较小的降低。第一次重复时,酶活力有较小的降低;在第二次重复使用时,丧失40%的活力;山梨醇脱氢酶的底物特异性常数Ks为51 mmol/L,单位生物量的山梨醇脱氢酶最大活力Umax为1.7U/mg干细胞。结论:山梨醇脱氢酶的稳定性较高。