α-突触核蛋白的结构生物学研究

α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)聚集形成纤维状结构,进而形成路易小体(Lewy bodies, LBs)。LBs是帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、多系统萎缩(multiple system atrophy, MSA)和路易小体痴呆(dementia with Lewy bodies, DLB)等神经退行性疾病的典型细胞病变特征,也是发病的一个关键环节。近年来,冷冻电镜技术的进步使解析高分辨率α-突触核蛋白原纤维结构成为可能。对α-突触核蛋白不同聚集形态的深入探究,能为理解神经退行性病变的分子机制、α-突触核蛋白毒性形式的性质以及α-突触核蛋白聚集影响的信号途径等提供帮助。本文综述目前已知的不同形态α-突触核蛋白结构,阐述α-突触核蛋白单体、寡聚体和不同聚集形式原纤维的结构特征。α-突触核蛋白寡聚体由于其结构不稳定,目前尚无明确的结构信息。但目前已有多个α-突触核蛋白原纤维结构被解析,包括重组蛋白体外制备的和多系统萎缩(MSA)患者体内分离的原纤维。这些原纤维直径由5 nm的单股原纤维至10 nm的双股原纤维不等。不同的体外制备条件可生成...     

α-突触核蛋白的结构特点及其功能

神经元胞浆内嗜酸性包涵体——Lewy体的出现是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的典型病理学特征,而α-突触核蛋白(α-synuclein)是纤维样Lewy体的主要成分。随着研究深入,越来越多的证据表明:α-突触核蛋白纤维性聚集体的产生是PD发病的一个关键环节。病理条件下,由于α-突触核蛋白的结构改变,导致错误折叠,继而纤维化,最终形成纤维性聚集体,这一过程在PD研究中日趋展现出其重要性。α-突触核蛋白结构中,N端、C端、NAC(non-amyloid component)区等区域具有各自特定的结构及功能,在其聚集体产生过程中各司其职。本文就近年来对α-突触核蛋白分子结构及其相应功能的研究进行综述,希望通过深入的综合分析,为寻找α-突触核蛋白结构中潜在的疾病治疗靶标提供理论依据。     

α-突触核蛋白与阿尔采末病

阿尔采末病(AD)在人群中的发病率逐渐上升,它是由多种因素共同作用所致。α-突触核蛋白(α-synuclein)在大脑皮质及海马等记忆相关部位广泛分布,目前研究发现其在AD的淀粉样斑块的形成、神经纤维缠结等机制中有重要作用,同时也是导致AD患者神经元损伤的重要因素。因此,α-突触核蛋白将成为今后AD研究的热点。     

SH-SY5Y细胞α-突触核蛋白的过表达可部分抵抗鱼藤酮诱导的氧化应激

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的发病机制涉及到遗传和环境因素。环境因素通过线粒休导致氧化应激和α-突触核蛋白（α—synuclein）聚集,但其确切的作用机制尚不明确。本文利用过表达α-突触核蛋白-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein．EGFP）的人多巴胺能神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y为模型,研究α-突触核蛋白对鱼藤酮诱导氧化应激的影响,从而进一步了解α-突触核蛋白和细胞存活之间的关系。（1）用荧光显微镜观察融合绿色荧光蛋白的α-突触核蛋白的表达情况;（2）用实时定量PCR检测α-突触核蛋白基因的表达;（3）用免疫细胞化学测定α-突触核蛋白的分布;（4）用不同浓度的鱼藤酮作用细胞后,以MTT法测细胞的活力、DCF法检测细胞的氧化应激状态、黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶的活力,并用流式细胞仪分析细胞的凋亡。实时定量PCR结果显示,α-突触核蛋白基因表达量在α-突触核蛋白过表达的细胞要高于SH—SY5Y细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白和α-突触核蛋白的表达。鱼藤酮可使细胞活力下降、线粒体complex Ⅰ的活性降低,诱导细胞内氧化应激,而过表达α-突触核蛋白的细胞可以部分抵抗鱼藤酮的毒性作用,表现为细胞抗氧化能力迅速增高（P〈0．05）和鱼藤酮诱导的细胞凋亡数目明显降低。本研究证明α-突触核蛋白对鱼藤酮产生的氧化应激有部分抵抗作用,而使过表达α-突触核蛋白的SH—SY5Y细胞对鱼藤酮的毒性作用表现出一定的耐受性。这种耐受性也可能是细胞对外界损害的一种代偿反应,从而促进细胞的存活。     

不同亚细胞定位的alpha-突触核蛋白对SK-N-SH细胞的毒性影响

在帕金森病中,alpha-突触核蛋白(α-synuclein)累积与聚集所产生的细胞毒性是发病的重要原因。本文目的是探求不同亚细胞定位的α-突触核蛋白对于细胞的毒性影响。分别在α-突触核蛋白前插入核输出序列(nuclear export sequence,NES)或核定位序列(nuclear localization sequence,NLS),使其特定地表达在细胞质或细胞核中。构建成功的质粒分别在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中表达,通过免疫荧光与Western印迹法检测蛋白质的表达情况。结果显示,NES-α-synuclein特异性地在细胞质中表达,NLS-α-synuclein特异性地在细胞核中表达。乳酸脱氢酶法检测结果表明,相较于WT-α-synuclein组,NES-α-synuclein组的乳酸脱氢酶的释放量减少26. 54%,NLS-α-synuclein组的乳酸脱氢酶释放量增加12. 85%。CCK8法检测细胞活性结果表明,相较于WT-α-synuclein组,NES-α-synuclein组的细胞活力提高35. 51%,NLS-α-synuclein组的细胞活力减少7. 93%。上述结果提示,胞质内表达α-synuclein对于细胞的毒性更小,而细胞核内表达的α-synuclein对细胞有更强的毒性作用。这些发现为研究帕金森病的分子机制提供了新的研究思路。     

基于肠脑轴传播α-突触核蛋白诱发帕金森病的研究进展

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是最常见的神经退行性疾病,随着我国人口老龄化加剧,PD病人的增加将造成严重的经济和医疗负担。PD的典型病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的死亡以及多巴胺能神经元中异常聚集的淀粉样蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)形成病理包涵体即路易小体(Lewy body)。研究发现路易小体不仅存在中枢神经系统中,也同样存在于外周神经系统。肠道内丰富的肠神经系统被称为“第二大脑”。肠脑轴的发现也证明α-Syn能在大脑和肠道进行双向传输。肠道中也存在着庞大的微生物群,这些微生物参与病理性α-Syn的形成和传输。因此文中基于肠脑轴探讨α-Syn在大脑和肠道的双向传输关系,尝试探索肠道微生物群对α-Syn异常聚集的影响。结合目前PD病人的研究和动物模型尤其是非人灵长类实验的研究,希望为PD疾病的筛查和诊断提供参考。     

重复急性低氧对小鼠大脑皮质中α-突触核蛋白表达的影响

利用本研究室制备的抗α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)单克隆抗体作为研究工具,在一种低氧预适应小鼠模型上研究了重复急性低氧对大脑皮层中α-SYN表达的影响。Western blot分析结果表明,小鼠在经过重复急性低氧刺激后,皮层脑组织内α-SYN蛋白含量呈现规律性的变化,表现为第一次急性低氧后明显增加,而经过重复低氧第4次后则回落,接近正常水平：免疫组化染色结果显示,α-SYN免疫阳性物质除存在于神经元的末梢外,还存在于某些神经元的核中。分析大脑皮质细胞核呈α-SYN免疫阳性的神经元的密度发现,核呈α-SYN阳性的神经元密度也在第一次急性低氧后明显增加,而经过重复低氧第4次后回落。以上结果提示,重复急性低氧能够改变α-SYN在脑内的表达水平以及α-SYN核阳性神经元的数量。这种变化的机制和生理意义有待于进一步探讨。     

α-突触核蛋白对小鼠空间学习记忆能力的影响

目的:观察α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)对小鼠空间学习记忆能力的影响。方法:以C57/B6野生型小鼠(Wild Type,WT)及α-Syn过表达转基因小鼠(Tg-α-Syn)为研究对象,采用Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)中定位航行实验、空间探索实验以及可视平台实验,按照训练要求,记录两组小鼠游泳路径和完成任务的时间。结果:在定位航行试验中,随着训练时间的增加,两组小鼠的寻台潜伏期均缩短。同时,在训练第五天时,与WT组小鼠相比,Tg-α-Syn小鼠的寻台潜伏期明显延长(58.77±1.32 versus 17.34±6.44,*P0.05)。在空间探索实验中,与WT组小鼠相比,Tg-α-Syn小鼠在目标象限停留时间更短(17.91±2.14versus 5.59±4.98,*P0.05)。为了进一步证明Tg-α-Syn小鼠的空间记忆与学习能力下降是与海马相关,采用了可视平台实验,结果显示:两组小鼠的寻台潜伏期无显著性差异(P0.05),即Tg-α-Syn小鼠不存在运动障碍和视觉障碍。结论:α-Syn过表达可导致海马相关的空间记忆、学习能力受损。     

α突触核蛋白作为帕金森病诊断标志物和治疗靶点

帕金森病(PD)是一种隐匿性和进行性发展的神经退行性疾病,在65岁以上人口中约占2％～3％,是第二大常见的神经退行性疾病.PD的致病因素尚未明确,但α突触核蛋白(α-synuclein)的错误折叠和聚集所形成的路易小体被认为是PD的典型病理学改变.由于缺乏可靠的生物标志物,PD的早期诊断较难.本文总结了PD患者不同样本...     

家蚕丝蛋白重复片段替换人体α-突触核蛋白核心片段的研究

家蚕Bombyx mori丝丝心蛋白(silk fibroin)结晶域与人类帕金森综合症的致病蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein, α-Syn)的积聚原理类似,都是由一段非常疏水的氨基酸组成的保守序列和一些无序卷曲,并在一定条件下发生整体的结构转换而发生纤维化所致。研究发现在这2种蛋白中存在的疏水片段是它们形成β折叠的关键。为了研究α-Syn蛋白的积聚核心在被别的积聚核心所替换后是否还可以正常纤维化,我们用PCR技术将家蚕丝丝心蛋白的核心片段替换α-Syn_1-74(α-Syn₇₄)的核心,组成一个重组蛋白α-Syn₇₄SFX,纯化后温育6天,用ThT荧光和原子力显微镜检测该重组蛋白的结构,结果表明α-Syn₇₄SFX未能发生纤维化。这说明具备能形成β片层的片段和无序卷曲这2个因素,并不能绝对使蛋白发生整体的结构转换。这对人工蚕丝的研究具有参考价值。     

综述与专论：α突触核蛋白作为帕金森病诊断标志物和治疗靶点

帕金森病(PD)是一种隐匿性和进行性发展的神经退行性疾病,在65岁以上人口中约占2%～3%,是第二大常见的神经退行性疾病。PD的致病因素尚未明确,但α突触核蛋白(α-synuclein)的错误折叠和聚集所形成的路易小体被认为是PD的典型病理学改变。由于缺乏可靠的生物标志物,PD的早期诊断较难。本文总结了PD患者不同样本中检测出的α突触核蛋白的最新进展,包括体液(脑脊液、血液、唾液)和周围组织(皮肤、嗅觉黏膜、唾液腺、肠道黏膜),以期进一步了解PD的生物标志物研究。此外,还综述了针对α突触核蛋白治疗PD的新进展。     

帕金森病中铁与Alpha-突触核蛋白的相互作用

帕金森病(Parkinson's disease,PD)的特异标志物Alpha-突触核蛋白的异常聚集往往伴有铁的沉积,说明铁与Alpha-突触核蛋白聚集之间存在一定联系。铁可以通过增加Alpha-突触核蛋白的产生及抑制其降解从而促进Alpha-突触核蛋白聚集。Alpha-突触核蛋白作为一种高铁还原酶也可以影响细胞铁的代谢。本文就铁与Alpha-突触核蛋白参与PD的发病以及两者之间相互作用的机制进行综述。     

Gamma- 突触核蛋白与肿瘤关系的研究进展

Synucleins家族是一种主要在神经元内表达的高度可溶性的蛋白家族。已知synucleins家族有3个成员α-synuclein(SNCA),β-synuclein(SNCB)和γ-synuclein(SNCG)。其中SNCA与SNCB参与神经递质释放过程,被认为与神经退行性变疾病密切相关,特别是在阿尔茨海默病与帕金森病中常有异常表达。近年来研究表明,SNCG在人类许多肿瘤中过表达,如乳腺癌、结直肠癌、女性生殖系统肿瘤、前列腺癌、膀胱癌等。通过研究表明γ-Synucleins异常表达机制目前包括DNA甲基化、激动蛋白-1激活、对转录因子SP1结合位点、有丝分裂检验点基因、雌激素受体影响。通过以上机制,SNCG促进上述肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡以及促进肿瘤细胞的转移。根据文献分析,我们提出SNCG可作为多种肿瘤预后的潜在指标的可能,同时以SNCG为切入点,探讨神经系统是否可以对肿瘤发生、发展的影响作用。     

α-突触核蛋白N-端结构域参与线粒体功能的调控

目的：确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法：构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达α-Synuclein蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞MN9D,通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及Cytochrome c释放。结果：成功构建了pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N融合蛋白质粒,免疫共沉淀明确α-Synuclein N-端为其功能结构域,JC-1染色发现N-端使线粒体膜电位降低,流式细胞术证实N-端使Cytochrome c释放明显增加。结论：α-Synuclein N-端是其与线粒体相互作用的功能结构域,N-端降低线粒体功能。     

原子力显微镜检测过表达α-突触核蛋白引起的线粒体结构变化

目的：利用原子力显微镜等方法,明确α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）过表达对线粒体的影响。方法：将腺相关病毒（AAV）载体介导表达的α-syn (AAV /α-syn)病毒包装颗粒,给大鼠脑内黑质区定位注射,建立α-syn过表达的大鼠模型,并以AAV介导表达的报告基因LacZ (AAV/LacZ)为动物对照组。提取大鼠黑质脑组织的线粒体,并通过JC1染色检测线粒体膜电势（ΔΨ）变化和Western Blot检测线粒体中α-syn蛋白量的变化;采用原子力显微镜观测线粒体表面结构的变化。结果：实验组大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,Western blot显示线粒体中α-syn蛋白量增加约2倍;JC1染色发现ΔΨ下降;原子力显微镜观测可见线粒体体积增大,线粒体膜表面出现较多孔道样改变。结论：大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,可导致α-syn蛋白在线粒体积聚;并可引起线粒体增大、膜形成孔道样改变、ΔΨ下降。     

α-synuclein致病机制和转基因帕金森疾病模型研究进展

α-synuclein是一种位于突触前末梢的蛋白,是遗传性和散发性帕金森病的特征性包涵体———路易小体的主要成分。α-synuclein基因突变或者遗传改变可导致帕金森病。大量研究揭示α-synuclein参与了神经元的变性过程。本文对α-synuclein在帕金森疾病中的神经元毒性机制以及α-synuclein转基因帕金森病动物模型研究进展进行了综述。     

异搏定拮抗α-石英细胞毒性作用的研究

借助于单细胞阳离子测定系统等手段,研究了不同细胞外钙浓度下异搏定作用后,细胞存活率与细胞内游离钙浓度(［Ca²⁺］_i)的变化关系.同时还研究了异搏定对实验性硅肺大鼠模型的作用.结果表明：由α-石英引起的肺泡巨噬细胞内钙升高是由于大量细胞外钙内流,造成细胞内钙超载,引起细胞死亡,并进一步导致硅肺形成.异搏定可以抑制细胞内钙增加,降低细胞的死亡.动物模型实验结果还表明异搏定对硅肺的发生有明显的抑制作用.提示异搏定可能成为硅肺的防治药物.     

胶质细胞在突触形成及突触传导中的作用

近年来,对胶质细胞功能的研究迅速发展.诸多研究都表明胶质细胞不仅为神经元功能发挥提供良好环境,而且还直接影响突触形成及其功能完善.此外胶质细胞也可以通过自身释放化学递质与神经元形成突触联系,参与对神经元兴奋性及突触传导的调节.     

右美托咪定对老年大鼠麻醉手术后对海马α-突触核蛋白表达和早期认知功能障碍的影响

摘要 目的：探讨右美托咪定对老年大鼠麻醉手术后对海马?琢-突触核蛋白表达和早期认知功能障碍的影响。方法：24只20-24个月龄SD大鼠机分为三组：对照组（不给予任何治疗,n=8）,麻醉手术组（在异氟烷麻醉下进行剖腹手术,n=8）,右美托咪定组（麻醉前30分钟,腹膜内注射25μg/ kg右美托咪定,在异氟烷麻醉下进行剖腹手术,n=8）。通过Y迷宫和爬杆测试分别评估干预措施对认知功能和运动行为的影响。通过蛋白质免疫印迹检测干预措施对α-突触核蛋白,S100β蛋白,caspase 3,Bax和Bcl-2表达的影响。通过RT-qPCR检测干预措施对TNF-α和IL-1β mRNA表达的影响。通过酶联免疫吸附测定干预措施对ROS,MDA和ATP表达水平的影响。通过免疫组织化学分析干预措施对NDUFV2,MT-ND1,SDHA和SDHC的表达水平的影响。结果：与对照组相比,麻醉手术组试验次数和爬杆时间、α-突触核蛋白、S100β、caspase 3和Bax蛋白表达水平、TNF-α和IL-1β mRNA表达水平、ROS和MDA水平均显著增加,Bcl-2蛋白表达、ATP水平以及NDUFV2、MT-ND1、SDHA和SDHC的表达水平均显著降低（P<0.05）;与麻醉手术组相比,右美托咪定组试验次数和爬杆时间、-突触核蛋白、S100β、caspase 3和Bax蛋白表达水平、TNF-α和IL-1β mRNA表达水平、ROS和MDA水平均显著降低,Bcl-2蛋白表达、ATP水平以及NDUFV2、MT-ND1、SDHA和SDHC的表达水平均显著增加（P<0.05）。结论：右美托咪定通过降低海马的炎症反应和神经元凋亡,以及增加α-突触核蛋白和S100β的水平,抑制线粒体功能障碍,保护老年大鼠麻醉术后早期认知功能障碍。     

蛋白质/多肽片段互补分析法检测alpha-突触核蛋白在细胞中的聚集

Alpha-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）聚集是引起帕金森病（Parkinson’s disease, PD）发生发展主要原因。本文用蛋白质/多肽片段互补分析法（protein-fragment complementation assays, PCAs）检测α-syn在细胞内的聚集。分别构建融合α-syn与人工改造的荧光素酶human Gaussiaprinceps luciferase（hGLuc）蛋白N端或C端蛋白的质粒,共转入人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,通过检测酶活性来确定野生型（wild type,WT）及A53T突变体α-syn在细胞中的聚集情况。结果表明WT和A53T突变α-syn都能使荧光素酶活性增强,而且与野生型α-syn相比,突变体A53T的荧光素酶活性更强,说明二者都能聚集,而且A53T聚集程度高于WT。PCAs法具有高灵敏度,不仅能检测α-syn在细胞内的聚集,而且能反映其聚集的程度,为研究帕金森病提供了研究思路和相应药物筛选的有效工具。