簇毛麦HMW-GS及其启动子基因的克隆与序列分析

利用2对特异引物,从簇毛麦(Dasypyrum villosum)基因组中分离克隆出一个簇毛麦HMW-GS基因VHG-2(GenBank登录号为FJ600492)及其启动子序列VHGp-1(GenBank登录号为FJ600489).VHGp-1序列长度为1 099 bp,从5′至3′方向依次有E-box、N-box、G-box、HMW谷蛋白特异38 bp增强子和TATA-box等典型的HMW-GS基因启动子作用调控元件,说明VHGp-1为簇毛麦HMW-GS的启动子基因.VHG-2序列长度为1 572 bp,具有单一完整的、可编码498个氨基酸的开放阅读框(ORF),该ORF推导的氨基酸序列结构分析表明,编码区依次包含由21个氨基酸残基组成的信号肽、105个氨基酸残基组成的N-末端区、330个氨基酸残基组成的中部重复区和42个氨基酸残基组成的C-末端区;中部重复区主要重复单元为6肽(PQQGQQ)和9肽(GYYPTSP/LQQ);有6个半胱氨酸残基(Cys),其中5个分布在N-末端区,1个分布在C-末端区,第3、4个相邻.这些特征与报道的y-型HMW-GS多肽结构基本一致,说明VHG-2是簇毛麦的y-型HMW-GS基因.系统进化分析表明,簇毛麦HMW-GS启动子序列(VHGP-1)与智利大麦(H.chilense)H基因组的D-hordein基因、拟鹅观草和阿拉善鹅观草St基因组的HMW-GS基因的启动子具有比较近的同源关系,簇毛麦HMW-GS基因(VHG-2)与冰草、拟鹅观草和中间偃麦草的y-型HMW-GS基因具有较近的同源关系.     

基于专化的反转录转座子序列开发鉴定簇毛麦染色质的PCR分子标记

通过克隆簇毛麦的专化序列,开发基于其序列的可用于鉴定簇毛麦染色质的PCR分子标记.用根据抗病基因保守域设计的XLS和A3简并引物进行PCR,检测到1条簇毛麦的特异PCR产物,酶切分析与测序结果表明:这条特异带由4类不同的片段组成,且都与反转录转座子具有同源性.以其中1个片段pHv29为探针进行Southern杂交,发现只有含有簇毛麦染色质的材料产生强的杂交信号,表明pHv29是一个对簇毛麦专化的反转录转座子序列.根据pHv29序列重新设计1对特异引物pHv29-F和pHv29-R,用一系列含有簇毛麦染色质的易位系或添加系的基因组DNA为模板进行PCR扩增,电泳结果表明pHv29433可以作为鉴定簇毛麦的染色质的分子标记.     

簇毛麦染色体的改良C—分带

运用改良的C-分带技术,使簇毛麦(Haynaldia villosa Schur)V染色体组的7对染色体全部显示出特异性的丰富带纹,包括与N-带相似的近着丝粒带以及N-带所不具有的末端带和亚端带。这些带纹使V组7对染色体之间以及簇毛麦染色体与小麦染色体之间能明确地相区分。     

外加电场对小麦和簇毛麦原生质体分裂和生长发育的影响

外加电场对小麦和簇毛麦原生质体分裂和生长发育的影响周爱芬,夏光敏,陈惠民（山东大学生物系,济南２５０１００）ＩＮＦＬＵＺＮＣＥＳＯＦＥＬＥＣＴＲＩＣＡＬＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮＯＮＴＨＥＤＩＶＩＳＩＯＮＧＲＯＮＴＨＡＮＤＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＯＦＰＲＯ...     

簇毛麦的利用价值和染色体操作

簇毛麦是小麦的一个野生近缘种,蛋白质和赖氨酸含量高,抗逆性和抗病性强,特别是对小麦白粉病的绝大多数生理小种表现免疫或高抗,是小麦品种改良中的一种潜在的抗性基因源。本文详细介绍了簇毛麦研究的历史和现状、簇毛麦染色体形态学、生化标记、分子细胞遗传学、分子标记等识别技术,以及簇毛麦与小麦组其它染色体组的关系     

簇毛麦的利用价值和染色体操作

簇毛麦是小麦的一个野生近缘种,蛋白质和赖氨酸含量高,抗逆性和抗病性强,特别是对小麦白粉病的绝大多数生理小种表现免疫或高抗,是小麦品种改良中的一种潜在的抗性基因源。本文详细介绍了簇毛麦研究的历史和现状、簇毛麦染色体形态学、生化标记、分子细胞遗传学、分子标记等识别技术,以及簇毛麦与小麦组其它染色体组的关系。     

普通小麦与簇毛麦双二倍体的合成,育性及细胞遗传学研究

通过杂种幼胚无性系培养获得大量再生植株F_1,经秋水仙碱处理,合成了普通小麦与簇毛麦属间双二倍体(AABBDDVV)。其形态特征除株高、穗长、小穗数,籽粒大小和育性明显增加,生育期延长外,分别与各自的再生植株F_1相似。双二倍体的体细胞染色体数目变化范围为48—56。花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ 2n=28Ⅱ的细胞占56.82％,每个细胞平均有27.10个二价体,1.44个单价体,0.08个三价体,0.03个四价体。经过连续两代单穗单株选择,结实率由15.91％提高到36.52％。     

Comparative study of symmetric and asymmetric somatic hybridization between common wheat and Haynaldia villosa

Symmetric and asymmetric protoplast fusion between long term cell suspension-derived protoplasts of Triticum aestivum (cv. Jinan 177) and protoplasts of Haynaldia villosa prepared from one-year-old embryogeneric calli was performed by PEG method. In asymmetric fusion, donor calli were treated with gamma ray at a dose of 40, 60, 80 Gy (1.3 Gy/min) respectively and then used to isolate protoplasts. Results of morphological, cytological, biochemical (isozyme) and 5S rDNA spacer sequence analysis revealed that we obtained somatic hybrid lines at high frequency from both symmetric and asymmetric fusion. Hybrid plants were recovered from symmetric and low dose γ-fusion combinations. GISH (genomic in situ hybridization) analysis proved exactly the existence of both parental chromosomes and the common occurrence of several kinds of translocation between them in the hybrid clones regenerated from symmetric and asymmetric fusion. And the elimination of donor DNA in hybrid clones regenerated from asymmetric fusion     

簇毛麦端体6VS的显微切割及其专化DNA序列的克隆和分析

从簇毛麦（Haynaldia villosa (L.)Schur.)组合CA9211／RW15（6D／6V异代换系）幼胚培养SC2后代中,用原位杂交方法鉴定出T240－6为6VS端体异代换系。以此为材料,采用微细玻璃针切割法及“单管反应”技术体系,对6VS进行切割分离及LA（Linker adaptor)-PCR扩增。扩增带在100－3000bp之间,大部分集中在600－1500bp。利用^32P标记的簇毛麦基因组为探针进行Southern杂交,证实扩增产物来源于簇毛麦。扩增产物纯化后,连续到pGEM-T载体上,构建了6VS DNA质粒库。对库的分析表明,库大约有17000个白色克隆;插入片段分布在100－1500bp,平均600bp。点杂交结果表明,37％克隆有中度到强烈的杂交信号,证明含有中度或高度重复序列;63％克隆有较弱的信号或没有信号,证明为单／低拷贝序列克隆。从库中获得8个簇毛麦特异克隆,对其中两个克隆pHVMK22和pHVMK134进行了RFLP分析和序列分析,并利用该探针对小麦抗白粉病基因Pm21进行了检测。RFLP结果表明,两个克隆一个为低拷贝序列克隆（pHVMK22),另一个为高度重复序列克隆,均为簇毛麦专化DNA序列。以pHVMK22为探针对抗、感病小麦（Triticum aestivum L.)品系的Southern杂交发现抗病品系有一条2kb的特征带,该探针可能作为检测抗病基因Pm21的探针。     

簇毛麦端体6VS的显微切割及其专化DNA序列的克隆和分析

从簇毛麦(Haynaldia villosa (L.) Schur.)组合CA9211/RW15(6D/6V异代换系)幼胚培养SC2后代中,用原位杂交方法鉴定出T240-6为6VS端体异代换系. 以此为材料,采用微细玻璃针切割法及"单管反应"技术体系,对6VS进行切割分离及LA (Linker adaptor)-PCR扩增.扩增带在100～3 000 bp 之间,大部分集中在600～1 500 bp.利用32P标记的簇毛麦基因组为探针进行Southern杂交,证实扩增产物来源于簇毛麦.扩增产物纯化后,连接到pGEM-T载体上,构建了6VS DNA质粒文库.对文库的分析表明,文库大约有17 000个白色克隆;插入片段分布在100～1 500 bp,平均600 bp.点杂交结果表明,37%克隆有中度到强烈的杂交信号,证明含有中度或高度重复序列;63%克隆有较弱的信号或没有信号,证明为单/低拷贝序列克隆.从文库中获得8个簇毛麦特异克隆,对其中两个克隆pHVMK22和 pHVMK134进行了RFLP分析和序列分析,并利用该探针对小麦抗白粉病基因Pm21进行了检测.RFLP 结果表明,两个克隆一个为低拷贝序列克隆(pHVMK22),另一个为高度重复序列克隆,均为簇毛麦专化DNA序列.以pHVMK22为探针对抗、感病小麦(Triticum aestivum L.)品系的Southern杂交发现抗病品系有一条2 kb的特征带, 该探针可能作为检测抗病基因Pm21的探针.     

簇毛麦染色体组特异性RAPD标记的筛选、定位和应用

以普通小麦中国春、中国春－簇毛麦二体附加系以及不同来源的簇毛麦为材料,用100个10碱基随机引物进行RAPD扩增。引物OPF02能在不同来源的簇毛麦及所有中国春－簇毛麦二体附加系中扩增出一条长约750bp的片段OPF02 750。普通小麦和硬粒小麦不能扩增出该片段。因此,OPF02 750为分布于簇毛麦所有染色体上的一个簇毛麦染色体组特异片段。用引物OPF02对普通小麦－簇毛麦双二倍体、硬粒小麦－簇毛麦双二倍体以及几个普通小麦的簇毛麦二体代换系、二体附加系进行检测,发现NAU302已经丢失了其所附加的簇毛麦3V染色体。     

筛选利用小麦微卫星标记追踪簇毛麦各条染色体

选用定位于普通小麦7个部分同源群上的276对微卫星引物对普通小麦中同春和簇毛麦的基因组DNA进行扩增分析,有148对引物可在两个物种间检测到多态性。利用上述显示多态性的引物进一步对7个中国春-簇毛麦二体附加系进行扩增分析,筛选出分别可用来追踪簇毛麦1V至7V染色体的引物wmc49（1BS）、wmc25（2BS）、gdm36（3DS）、gdml45（4AL）、wmc233（5DS）、wmc256（6AL）和gwm344（7BL）。此外还发现6DS上的微卫星引物gwm469可以用来追踪簇毛麦的2V染色体;2DS上的微卫星引物gdm107可用来追踪簇毛麦的6V染色体。进一步用涉及不同簇毛麦和小麦背景的小麦一簇毛麦染色体附加系、代换系和易位系进行扩增分析,这些微卫星标记也可用来鉴定簇毛麦的各条染色体。因此,这然簇毛麦染色体特异的微卫星标记可用来追踪普通小麦背景中的簇毛麦染色体。     

同一小麦品种不同来源的两种原生质体与簇毛麦原生质体融合再生杂种植株

小麦(Triticum aestivum L.)济南177的两种原生质体,一种来自快速生长的悬浮细胞,它们因长期继代而丧失分化能力, 其染色体只有2n=24～28;另一种来自可以再生的愈伤组织,其原生质体不能持续分裂.它们中任一种与UV照射过的簇毛麦原生质体融合均不能再生植株.然而当它们混合在一起作为受体时,能够获得再生绿色植株.细胞核基因和胞质基因的分析证明这些绿色植株是杂种.以上事实说明这两种原生质体在融合时存在某些互补的关系,讨论了这种融合方式的可能作用及重要性.     

Asymmetric somatic hybridization between Triticum aestivum L. and Haynaldia villosa Schur

Suspension cell-derived protoplasts of wheat, inactivated with different concentrations (0-2.5mol/L) of IOA, were fused by PEG method with the Haynaldia villosa protoplasts which originated from the calli 4-5d after subculture and were irradiated with 60Co-γ ray. Cell colonies, calli or regenerated plants were obtained from different combinations of fusion. The calli and plants were verified to be hybrids by chromosome counting, isozyme analysis and morphological inspection.     

Transmission of 6VS Chromosome in Wheat- Haynaldia villosa Translocation Lines and Genetic Stability of Pm21 Carried by 6VS

Fa plants from Yang94-138 ×92R149 were analyzed using species-specific probe pHv62 for Haynaldia villosa (L.) Schur and RFLP probe Psrll3 located on the short ann of homoeologous group six for wheat ( Triticum aestivum L. ). The results showed that the transmission rate of 6VS in the F2 was 69.5 %, which was close to the expected value of 75%. 147 F2 plants from the above Fl plant were tested for their resistance in seedling stage to 6 pathogenic strains of powdery mildew. It was observed that Pm21 genes on 6VS inherited dominantly and expressed well when transferred to wheat－"Yangmai 158" genotype.     

簇毛麦中一种新型高分子量麦谷蛋白亚基基因序列的研究

簇毛麦(Haynaldia villosa)是普通小麦品质改良的重要亲本之一。利用基因组PCR的方法从簇毛麦中克降到一个新的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW—GS)基因(HayviG1)全编码序列,内有2个终止密码,可能是1个假基因。从推导的氨基酸序列同源性分析表明：HayviG1编码1个新的HMW-GS亚基,聚类分析表明与长穗偃麦草的Agelog5以及圆柱山羊草的1Cy具有较近的同源性。