Cry1Ab/Cry1Ah杂合蛋白构建与功能研究

Cry1A类杀虫蛋白是目前应用最为广泛的杀虫蛋白,目前已经报道的Cry1A类杀虫蛋白之间存在普遍的结构域交换现象。针对鳞翅目害虫具有高活性的Cry1Ab与Cry1Ah蛋白开展研究,构建了Cry1Ab、Cry1Ah的杂合蛋白AhAhAb并测定了杀虫活性。结果显示,Cry1Ab、Cry1Ah的结构域交换引起蛋白杀虫活性的显著变化,与出发蛋白相比,杂合蛋白AhAhAb丧失了对棉铃虫杀虫活性,降低了对玉米螟、小菜蛾杀虫活性。利用生物信息学方法对Cry1Ah结构域I建模,并分析其与其他Cry1A蛋白结构及表面性质差异,分析表明Cry1Ah与Cry1Ab的结构域I有相同的碳骨架和二级结构,但是表面电势分布有较大差异。进一步分析杂合蛋白AhAhAb与Cry1Ab、Cry1Ah之间杀虫活性差异的原因对进一步揭示Cry1A类蛋白杀虫特异性进化规律有重要意义。     

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94 μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。     

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/...     

Cry1Ac和Cry2Ab杀虫蛋白对粘虫幼虫生长发育的影响

【目的】为探究Bt杀虫蛋白对次要靶标害虫粘虫Mythimna separata (Walker)(鳞翅目:夜蛾科)的杀虫活性及对其生长发育的影响。【方法】本文通过浸叶法饲喂初孵及2龄末粘虫不同剂量的Cry1Ac及Cry2Ab杀虫蛋白后,观察其死亡率,称量幼虫重,并统计了幼虫历期、化蛹率、蛹重、蛹期、蛹的羽化率、畸形率等指标。【结果】初孵幼虫取食浸泡含16、64、128μg/mLCry1Ac及Cry2Ab的玉米叶片后,随着时间的延长及浓度的增加,死亡率逐渐增加,且Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫的生物活性高于Cry2Ab蛋白,在128μg/mL浓度下,取食Cry1Ac和Cry2Ab蛋白13d时的死亡率分别达到了65%及60%。取食两种蛋白后,初孵幼虫和2龄末幼虫重量均受到显著抑制,短期取食两种蛋白对幼虫历期、化蛹率、蛹重、蛹期、蛹的羽化率、畸形率没有影响。【结论】取食Cry1Ac和Cry2Ab杀虫蛋白后,对初孵幼虫有很好的杀虫活性,且Cry1Ac杀虫活性高于Cry2Ab杀虫蛋白;短期饲喂两种杀虫蛋白时,对2龄粘虫后期生长影响不大。本文结果为转Bt基因作物更好的应用于粘虫的防治提供了理论基础。     

Cry2Ab及Cry1Ac杀虫蛋白对棉铃虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确Cry2Ab和Cry1Ac2种Bt杀虫蛋白单用与混用对棉铃虫Helicoverpa armigera（Htibner）中肠主要蛋白酶活性的影响,本文测定了取食含不同Bt蛋白人工饲料后棉铃虫中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的差异。结果发现：Cry2Ab处理12h后对棉铃虫中肠总蛋白酶影响不大;对类胰蛋白酶的影响最大,除最高浓度处理外,其他浓度处理后棉铃虫类胰蛋白酶的活性明显高于对照;但对类胰凝乳蛋白酶活性的影响呈倒“V”字型,只有6．67ug／gCry2Ab处理后的棉铃虫酶活力显著高于对照,其他浓度处理与对照差异不显著或略低于对照;随着取食含Cry2Ab饲料时间的增加,棉铃虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性比对照显著增加;与对照相比,处理36h后类胰蛋白酶活性最高可增加到6．43倍。Cry1Ac处理棉铃虫12h后总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性都明显增加,而且与处理浓度呈正相关;但是24h后,处理后棉铃虫的总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性明显降低,只有类胰蛋白酶活性仍高于对照,但活性增长倍数低于12h时的处理。Cru2Ab和Cry1Ac2种蛋白混用处理棉铃虫后,2种酶的酶活力基本低于Cry1Ac和Cry2Ab单用的酶活力之和;只有2种蛋白浓度均为2．22ug／g混用时,处理12h后类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性高于2种蛋白单用时酶活力之和,且都显著的高于对照。     

转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田浮游动物群落物种多样性的影响

为了解转Bt基因抗虫水稻对稻田浮游动物群落的安全性,本文以转Cry1Ab/Ac基因水稻"华恢1号"(HH1)为试验材料,以其非转基因亲本水稻"明恢63"(MH63)为对照,以浮游动物为指示生物,通过湖南湘潭基地连续3年的大田实验,研究了转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田浮游动物群落物种多样性的影响。结果表明:HH1与MH63两稻田生境浮游动物群落相似性高于0.70,优势种组成相似性高于0.89;浮游动物群落结构各参数的时间动态与总体分析均无显著差异;转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻HH1对稻田浮游动物群落物种多样性无不良影响。     

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响

【目的】为探究转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响。【方法】以转Cry1Ac/1Ab基因棉与其亲本常规棉为实验材料,利用取食不同棉花品种叶片的棉铃虫饲喂异色瓢虫幼虫。【结果】与常规亲本棉相比,取食饲喂转基因棉花叶片的初孵棉铃虫幼虫的异色瓢虫幼虫从1龄发育至化蛹期时间延长0.77 d,但差异不显著;除1龄幼虫体重增加(0.0773 mg)外,其余各龄期幼虫体重均有所下降,但差异均不显著;异色瓢虫1、2、3、4龄幼虫对初孵棉铃虫捕食量均随棉铃虫密度的增加而增加,捕食功能反应均符合HollingⅡ圆盘方程。【结论】转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育无显著影响,饲喂取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花的棉铃虫对异色瓢虫捕食功能无显著差异。     

转Bt棉主茎叶Cry1Ab/c蛋白含量的时空分布分析

为明确M-49和X-37转基因棉Cry1Ab/c蛋白在主茎叶片的时空分布,采用酶联免疫法(ELISA)对主茎叶片的Cry1Ab/c蛋白含量进行检测,并利用考马斯亮蓝法检测叶片水溶性总蛋白含量。结果表明:X-37主茎叶片Cry1Ab/c蛋白整体含量高于M-49;两种转Bt棉主茎叶的Cry1Ab/c蛋白含量由顶端向底层逐渐增加,现蕾期(6月3日)和初花期(6月27日)底层叶片Cry1Ab/c蛋白含量显著高于顶端叶片;花铃期(8月6日)和铃期(8月26日)中上部叶片Cry1Ab/c蛋白含量均无明显差异。另外,在初花期(6月27日)主茎上部叶片的Cry1Ab/c蛋白与水溶性总蛋白比显著高于中下部叶片。总体上,两种转Bt棉主茎叶片Cry1Ab/c蛋白叶片含量分布由下至上逐渐减少,随生育期的推进呈先增后降,在初花期的上部叶片Cry1Ab/c蛋白与水溶总性蛋白比变化较其他生育期明显。     

Bt蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah对玉米蚜的效应评价

[目的] 探讨转基因玉米表达的3种Bt蛋白对非靶标害虫玉米蚜的影响效应,为农田生态系统中转基因玉米的环境安全评价提供依据。[方法] 在玉米蚜全纯人工饲料中分别添加Bt蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah饲养玉米蚜,并以PBS缓冲液或Na₂CO₃溶液为阴性对照,添加酪蛋白（casein,CS）为中性对照,添加印楝素（neem oil）为阳性对照,比较分析Bt蛋白等各处理对玉米蚜存活率、发育历期、有翅蚜率及繁殖力的影响。[结果] 低浓度印楝素（Neem-L）处理后玉米蚜半数个体生存时间（ST₅₀）为3.2~4.0 d,高浓度印楝素（Neem-H）处理后,玉米蚜在第4天全部死亡,这2个处理均没有子代若蚜产生。添加Bt蛋白和CS对玉米蚜的生存时间没有显著影响,ST₅₀在8.3~9.6 d之间。与阴性对照相比,3个Bt蛋白和CS处理的若蚜期显著短1.0~2.9 d,产出的下一代若蚜数显著增多。Vip3Aa19、Cry1Ab以及CS处理后,有翅蚜比例显著高于其阴性对照。[结论] 饲料中分别添加3种Bt蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah对玉米蚜的存活率没有显著影响,但具有与添加CS等同提高饲料营养质量的效果;与阴性对照相比,添加3种Bt蛋白对玉米蚜的生长发育和繁殖具有显著的促进效应。     

泥鳅对饲料中添加转融合基因Cry1Ab/Ac水稻花粉的响应

以转Cry1Ab/Ac抗虫水稻华恢1号(HH1)花粉为添加剂,配制4种不同花粉含量(1%、5%、10%、20%)的饲料,以非转基因亲本水稻明恢63(MH63)花粉为对照,常规泥鳅饲料(不添加花粉)为阴性对照,投喂100 d,通过泥鳅的生长指标和肝脏生理酶活性评价转Cry1Ab/Ac抗虫水稻HH1号花粉对泥鳅的安全性。结果表明,在饲料中分别添加相同比例的HH1与MH63花粉,两组泥鳅的增重率、脏体比和肝体比指数均无显著差异,同时对泥鳅的肝脏抗氧化保护酶SOD、CAT活性与解毒酶GST活性也均无显著影响。饲料中花粉含量为20%时,在饲养100 d后,转Cry1Ab/Ac水稻花粉对泥鳅的生长性能与肝脏生理酶代谢功能没有明显影响。因此,转Cry1Ab/Ac抗虫水稻HH1号花粉对泥鳅无明显的生态风险。     

转Cry1Ab基因水稻分子特征及其特异性PCR检测方法

转Cry1Ab基因水稻Bt01为一种新型的转基因水稻,文章首先利用Southern blotting验证了外源基因Cry1Ab转入了Bt01中,且为单拷贝,再利用TAIL-PCR方法获得了其插入位点信息,根据获得的Bt01的5′端插入位点序列,设计了相应的定性与定量PCR检测体系的引物及探针,实验结果显示,定性PCR检测体系的最低检测极限(LOD)为10个拷贝,定量PCR检测体系的LOD为5拷贝,最低定量极限(LOQ)为10拷贝。同时为了验证建立的定量PCR体系的准确性,利用该体系检测已知转基因水稻Bt01含量分别为3%和0.5%的样品,定量结果分别为2.7%和0.47%。研究结果表明,该转化体特异性定性与定量检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因水稻Bt01的身份识别和检测提供了有效的方法。     

草地贪夜蛾取食Cry1Ab和Cry1Fa蛋白后中肠转录组及ABC基因表达分析

【目的】为揭示草地贪夜蛾Spodoptera furgiperda幼虫取食Bt蛋白后与中肠上相关ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette transporter, ABC)蛋白基因的表达量变化的关系。【方法】分别使用含活化晶体蛋白Cry1Ab (LC₇₀=240.2 μg/g)和Cry1Fa (LC₇₀=270.0 μg/g)蛋白的人工饲料饲喂草地贪夜蛾4龄幼虫48 h,利用高通量测序对中肠进行转录组测序并进行生物信息学分析,筛选处理后差异表达基因;利用RT-qPCR验证差异表达ABC基因的表达量。【结果】与饲喂正常人工饲料的对照相比,饲喂含240.2 μg/g Cry1Ab和270.0 μg/g Cry1Fa的人工饲料后草地贪夜蛾4龄幼虫中肠转录组中分别检测到1 305和1 202个差异表达基因。Cry1Ab和Cry1Fa处理组与对照组之间分别有994和912个差异表达基因被GO功能注释到生物学过程、分子功能和细胞组分三大类。在最终筛选到的9个差异表达的ABC家族基因中,Cry1Ab处理组与对照组之间有4个差异表达ABC基因,3个上调,1个下调; Cry1Fa处理组与对照组之间有5个差异表达ABC基因,2个上调,3个下调;Cry1Ab和Cry1Fa处理组与对照组之间有2个ABC基因(LOC118267200和LOC118267201)表达量均显著上调。RT-qPCR验证结果表明,与对照组相比,Cry1Ab处理组有3个ABC基因表达量极显著上调,2个ABC基因表达量下调;Cry1Fa处理组有5个ABC基因表达量上调,1个ABC基因表达量下调。【结论】Cry1Ab和Cry1Fa蛋白的摄入可以影响草地贪夜蛾幼虫中肠一些ABC家族基因的表达量变化,这些基因的表达量变化与昆虫抗性产生有关。经比对后发现,ABCC家族与ABCG8基因表达量变化显著。本研究为下一步明确草地贪夜蛾体内ABC转运蛋白在Bt蛋白杀虫机制中的作用,以及合理使用Bt蛋白防治草地贪夜蛾及延缓抗性提供了理论依据。     

转Cry1Ab基因水稻分子特征及其特异性PCR检测方法

转Cry1Ab基因水稻Bt01为一种新型的转基因水稻, 文章首先利用Southern blotting验证了外源基因Cry1Ab转入了Bt01中, 且为单拷贝, 再利用TAIL-PCR方法获得了其插入位点信息, 根据获得的Bt01的5′端插入位点序列, 设计了相应的定性与定量PCR检测体系的引物及探针, 实验结果显示, 定性PCR检测体系的最低检测极限(LOD)为10个拷贝, 定量PCR检测体系的LOD为5拷贝, 最低定量极限(LOQ)为10拷贝。同时为了验证建立的定量PCR体系的准确性, 利用该体系检测已知转基因水稻Bt01含量分别为3%和0.5%的样品, 定量结果分别为2.7%和0.47%。研究结果表明, 该转化体特异性定性与定量检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性, 为转基因水稻Bt01的身份识别和检测提供了有效的方法。     

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉对棉蚜生命表参数及种群动态的影响

为研究新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉对棉蚜Aphis gossypii Glover生命表参数及种群动态的影响。2010—2011年以常规棉中棉所49为对照,对新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉在室内进行了生物测定和田间进行了系统的调查。结果表明,和常规棉相比,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花上棉蚜的净增值率降低81.69%,差异达显著水平;内禀增长率和周限增长率分别降低65.00%和13.01%,但差异不显著;平均世代周期和种群加倍时间分别增加5.54%和154.19%,后者差异达显著水平。和常规棉相比,2010年转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花百株苗蚜、伏蚜和秋蚜的数量分别降低10.79%、37.18%和17.49%,差异均未达显著水平;2011年转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花百株苗蚜的数量增加2.03%,伏蚜和秋蚜的数量分别降低37.41%和64.03%,差异均未达显著水平。     

利用花青素可视化跟踪表达系统快速筛选表达Cry1Ab/c基因的转基因玉米

以草甘膦抗性基因Epsps为标记基因, 在原核Kan^r基因两侧引入Cre(环化重组酶)基因识别的Lox-P位点, 同时以编码花青素合成转录因子的Bi和Cl基因为可视化选择报告基因, 构建了Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/c的可视化跟踪表达载体pBAC9017。用PDS1000/He基因枪转化玉米(Zea mays)自交系501的幼胚和胚性愈伤组织, 获得147个草甘膦抗性的玉米再生植株。其中106棵植株获得了结实种子, 16棵植株的结实种子有紫红色花青素基因的表达。经PCR检测表明, 外源Cry1Ab/c基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株种子蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条和ELISA检测, 结果表明, Cry1Ab/c在部分转基因植株后代中表达。     

转Cry1Ac+Cry2Ab棉花生长势及其对棉田节肢动物物种丰富度的影响

【背景】转基因棉花在商业化种植之前,必须评价其环境安全性。其中新型棉花材料的生存竞争能力和对物种丰富度的影响是评价的重要内容。【方法】以转Cry1Ac＋Cry2Ab基因棉为试验材料,转Cry1Ac棉花中棉所41和非转基因棉花中棉所49为对照品种,分别于2014年5~9月对棉花株高、主茎叶片数、叶绿素含量、比叶面积、果枝数、蕾铃数等生长参数进行比较,同时对二代、三代和四代棉铃虫发生期棉田物种丰富度进行系统调查。【结果】转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花的生长势与转Cry1Ac棉花和非转基因棉花基本相当,没有表现出明显的竞争优势;产量构成参数在成铃和脱落等方面比非转基因棉表现出良好的优势。对棉田节肢动物物种丰富度的影响表明,转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花对靶标害虫棉铃虫具有良好的控制效果,对主要刺吸性害虫棉蚜、棉蓟马、烟粉虱、绿盲蝽与天敌龟纹瓢虫、草间小黑蛛、草蛉和小花蝽等的种群丰富度在个别时期有所影响,但总体上与转Cry1Ac棉田和非转基因棉田没有显著性差异。【结论与意义】转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花无竞争优势,但目标性状优势较好;对棉田节肢动物物种丰富度无明显影响。研究结果为新型转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花对棉田环境安全方面的研究进一步补充了内容,为转基因棉花的环境安全评价提供科学数据。     

苏云金杆菌辅助蛋白P20对杀虫晶体蛋白Cry1Ab表达的影响

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C半端缺少了一段含4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定,报道苏云金杆菌辅助蛋白P20帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT3101构建3个表达质粒,即pT1B、pP1B和pDP1B,3个质粒都含有cry1Ab基因,不同在于pT1B没有p20基因,pP1B含有p20全基因,而pDP1B不仅含有p20全基因,且在p20基因前插入cry1A?启动子。分别将这3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中,获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Western blot表明cry1Ab基因在这3株菌中均表达了130 kD的蛋白,部分降解为大约60 kD的蛋白。蛋白定量分析显示,3株菌130 kD蛋白量的比为1∶1.4∶1.5,降解后的60 kD蛋白量的 比为1∶1.1∶1.6,Cry1Ab蛋白总量的比为1∶1∶2∶1.6。镜检发现,Cry1Ab在3株菌中都形成典型的菱形晶体,其晶体大小为T1B Helicoverpa armigera）均具有明显的杀虫活性,三者的LC₅₀差异不显著。研究表明,P20对cry1Ab基因的表达和晶体形成均有帮助,P20表达量的多少可能是导致Cry1Ab蛋白最终产量有所不同的因素。     

Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫的安全性研究

【目的】转基因作物对非靶标昆虫的影响是转基因作物环境安全评价的重要内容,研究Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫的影响,对转基因作物的环境安全评价具有重要意义。【方法】采用实验动物学、分子生物学等方法,研究Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫发育历期、成虫体重、雌雄比例及体内氨基酸种类和含量的影响。【结果】与蔗糖对照组相比,Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫不同龄期的发育历期、成虫体重和雌雄比例均无明显差异,对体内氨基酸种类和含量也没有显著差异。【结论】Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫的生长发育及代谢无显著影响。     

Pesticidal and Receptor Binding Properties of Bacillus thuringiensis Cry1Ab and Cry1Ac δ-Endotoxin Mutants to Pectinophora gossypiella and Helicoverpa zea

Bacillus thuringiensis produces several larvicidal crystalline inclusions during sporulation. An understanding of their mechanisms of action is commercially important. In this study, two toxins, Cry1Ab and Cry1Ac, were compared that showed 98% amino acid identity in domain I and II, but differed significantly in domain III. Using site-directed mutagenesis techniques, two conserved loop 2 Arg's (³⁶⁸RR³⁶⁹) of Cry1Ab and Cry1Ac toxins were replaced with Ala (³⁶⁸AR³⁶⁹, ³⁶⁸RA³⁶⁹, ³⁶⁸AA³⁶⁹), Glu (³⁶⁸EE³⁶⁹), Phe (³⁶⁸FF³⁶⁹), His (³⁶⁸HH³⁶⁹), and Lys (³⁶⁸KK³⁶⁹). The effect of these mutants on structural stability, larvicidal potency, receptor binding, and ionic permeability towards two important cotton pests, pink bollworm (Pectinophora gossypiella) and bollworm (Helicoverpa zea) were analyzed. All seven mutants of Cry1Ab, excluding ³⁶⁸AR³⁶⁹, produced a stable protoxin, whereas for Cry1Ac all seven mutants yielded stable protoxin. Results showed that all the stable mutants behaved similarly to the wild type on incubation with trypsin and gut extract of both insect larvae. The Cry1Ab mutants, ³⁶⁸AR³⁶⁹, ³⁶⁸AA³⁶⁹, ³⁶⁸FF³⁶⁹, and ³⁶⁸HH³⁶⁹, lost toxicity; ³⁶⁸EE³⁶⁹ had reduced toxicity; whereas the more conserved change ³⁶⁸KK³⁶⁹ retained the toxicity similar to the wild type towards P. gossypiella. Double mutants of Cry1Ac, ³⁶⁸AA³⁶⁹ and ³⁶⁸FF³⁶⁹, abolished the toxicity. Double mutant ³⁶⁸KK³⁶⁹ of Cry1Ac retained its toxicity against P. gossypiella, whereas single mutants ³⁶⁸AR³⁶⁹, ³⁶⁸RA³⁶⁹, and ³⁶⁸HH³⁶⁹ retained only reduced toxicity. All the mutants of Cry1Ab lost their toxicity against H. zea except ³⁶⁸KK³⁶⁹. In Cry1Ac single mutants, ³⁶⁸AR³⁶⁹ and ³⁶⁸RA³⁶⁹, reduction in the toxicity was observed. A double mutant of Cry1Ac, ³⁶⁸KK³⁶⁹, also retained reduced toxicity. All the other double mutants lost their toxicity. Voltage clamping experiments on H. zea midguts provided an additional evidence about the insecticidal property and inhibition of I_sc across the transepithelial membrane of the insect midgut. Received: 5 June 2000 / Accepted: 5 July 2000     

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

【目的】新型转基因棉花在进入大规模商业化应用前,需对其生态环境安全性进行评价;同时,经基因改造的新型转基因抗虫棉花可能影响抗虫棉的次生代谢,进而导致一些综合的生态学效应,致使棉花生理上发生改变,这也是转基因植物安全性评价研究的重要内容。【方法】比较了不同关键时期新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花与转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比、主要酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、营养物质(蛋白质、氨态氮、脯氨酸和可溶性糖)和次生代谢产物(棉酚和单宁)含量的差异及其对棉田不同昆虫营养层昆虫个体总数和物种数的影响。【结果】棉花生长的蕾期、花期和花铃期,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势;SOD和POD活性在花铃期明显升高,CAT、APX和GR活性无显著变化;蛋白质、氨态氮含量无明显变化,脯氨酸和可溶性糖含量均表现为先升高后下降的趋势;棉酚含量在3个时期无显著变化,而单宁含量呈逐渐升高的趋势。3种棉花叶片中干物质积累、主要酶活性、营养物质和次生代谢产物含量均无显著差异;单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花转Cry1Ac基因棉花非转基因棉花,小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花非转基因棉花;昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数均表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田转Cry1Ac基因棉田非转基因棉田,天敌亚群落昆虫个体总数无显著变化;3种棉田中昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的物种数均未发生显著变化。【结论】转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花叶片干物质积累、产量性状、生化物质含量、酶活性在不同生长期表现不同,但上述参数在3种棉花之间无显著差异;且转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花具有较好的抗虫性,能有效降低棉田害虫数量。