酵母tRNA~(Ala)3'端第四个核苷酸在tRNA-氨酰基tRNA合成酶识别中的作用

用逐步高碘酸氧化法除去酵母tRNA~(Ala) 3'端的pACCA;最终产物用tRNA_O~(Ala)表示;用T_4 RNA连接酶使tRNA_C~(Ala)接上pAp、pGp、pCp、pCCCA和pUCCA;经磷酸单酯酶处理、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,测得tRNA_(CA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)、tRNA_(CC)~(Ala)、tRNA_(CCCCA)~(Ala)和tRNA_(CUCCA)~(Ala)接受丙氨酸的活力,分别是80%、36%、12%、6%和8.8%(以tRNA~(Ala)的活力为100%计)。tRNA_(CA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)和tRNA_(CC)~(Ala)首先被混合氨酰基tRNA合成酶制剂中的转核苷酸酶,在CTP和ATP存在的情况下,加上了CCA末端。实验证明,酵母tRNA~(Ala)3'端第四个核苷酸对于合成酶-tRNA的识别是重要的,但又非绝对必需的。     

不同年龄小白鼠全脑细胞质氨酰tRNA合成酶活力的比较

从不同年龄(20天,30天,1年)的小白鼠全脑制得细胞质混合氨酰tRNA合成酶。用异源体系(即用酵母tRNA和小白鼠全脑氨酰tRNA合成酶)测定了氨酰tRNA合成酶分别载运~3H标记的Asp、Gly、Glu、Lys和Ala的活力。结果表明除未检出tRNA~(Glu)的合成酶活力外,对其余四种氨基酸都有明显的活力,特别是年龄20天小白鼠的氨酰tRNA合成酶对~3H-Gly具有高达35％的载运活力。对~3H-Gly、~3H-Lys和~3H-Ala的载运活力有随增龄而下降的趋势,但对~3H-Asp的载运活力则随年龄增长而增高。     

毕赤酵母中tRNA_(CCG)~(Pro)基因的表达及其作用效果

转运核糖核酸(tRNA)是蛋白质合成过程中重要参与成分之一,为了探索稀有密码子对应的tRNA(稀少tRNA)丰度改变对外源基因表达量的影响,文中构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。首先在GFP基因中添加由4个连续脯氨酸稀有密码子CCG组成的阻遏区,结果显示该GFP基因的表达量明显降低。然后将带有阻遏区的GFP基因和tRNA_(CCG)~(Pro)基因顺次连接于pPIC9K载体上,在毕赤酵母GS115中共表达,结果使GFP表达量提高了4.9%;另将带有阻遏区的GFP基因和tRNA_(CCG)~(Pro)基因分别连接于pPIC9K和pFLDα载体,在毕赤酵母GS115中共表达,GFP表达量最高提高了12.5%;应用同样方式将tRNA_(CCG)~(Pro)基因与NFATc3T-GFP融合基因共表达,其表达量提高了21.3%。可见,tRNA_(CCG)~(Pro)在毕赤酵母GS115中确为稀少tRNA,通过共表达tRNA_(CCG)~(Pro)基因可显著提高带有连续该密码子的外源基因表达量,并且,文中构建的共表达体系将同样适用于其他稀少t RNA基因的筛选和验证。     

蓖麻蚕(Philosamia cynthiaricini)后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸的全核苷酸顺序

按照Sanger等建立的前标记指纹图谱法,并采用稍加改进的电泳装置,测定了蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸(tRNA~(Gly))的全核苷酸顺序。它由74个核苷酸组成,反密码子为GCC。每分子tRNA~(Gly)含T、ψ、D和m~1A各一分子,3.2分子m~5C和约0.4分子Um。与家蚕(Bombyx mori)tRNA_1~(Gly)(反密码子为GCC)比较,蓖麻蚕tRNA~(Gly)仅在某些部位上修饰程度较低。除此以外,两者顺序非常相似。文中讨论了真核生物tRNA~(Gly)的结构特征和均一性。     

蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricint)后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸的全核苷酸顺序

按照Sanger等建立的前标记指纹图谱法,并采用稍加改进的电泳装置,测定了蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸(tRNA~(Gly))的全核苷酸顺序。它由74个核苷酸组成,反密码子为GCC。每分子tRNA~(Gly)含T、ψ、D和m~1A各一分子,3.2分子m~5C和约0.4分子Um。与家蚕(Bombyx mori)tRNA_1~(Gly)(反密码子为GCC)比较,蓖麻蚕tRNA~(Gly)仅在某些部位上修饰程度较低。除此以外,两者顺序非常相似。文中讨论了真核生物tRNA~(Gly)的结构特征和均一性。     

携带线粒体tRNA~(Thr) 15943T>C协同12S rRNA 1555A>G突变的非综合征性耳聋致病机理的初步研究

该研究通过构建携带线粒体tRNA~(Thr )15943TC协同12S rRNA 1555AG突变(双突变组)的永生化淋巴母细胞系,同时建立仅含12S rRNA 1555AG突变(单突变组)和正常对照组永生化淋巴母细胞系,探究线粒体tRNA~(Thr )15943TC协同12S rRNA 1555AG突变与耳聋发病的关系,以了解线粒体突变致聋的分子机制。对该家系的临床资料进行分析的结果表明,当包括使用氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside antibiotic,AmAn)的药物性耳聋家系成员时,此家系耳聋外显率为26%;当排除用药的耳聋成员时,此家系耳聋外显率是10%;相比之下,已报道的14个m.1555AG的耳聋家系的平均外显率在用药和未用药的情况下分别仅为13%和6%。利用Northern blot和Western blot分别检测三组细胞中线粒体tRNA和多肽的表达量,结果表明相比于正常对照组,tRNA~(Thr)在双突变组中的表达量显著降低,而在单突变组中的表达量无显著变化,tRNA~(Trp)、tRNA~(Ala) 、tRNA~(Tyr) 、tRNA~(Cys)和tRNA~(Pro)的稳态水平在三组细胞中没有显著性差异;CO2、CO3和A6在双突变组中的表达量显著降低,而在单突变组中的表达量无显著性差异;其他蛋白多肽在三组细胞中的表达量没有显著差异,说明m.15943TC突变降低了tRNA~(Thr)的稳态水平,致使线粒体部分多肽表达水平下降,从而影响了线粒体呼吸链复合体的功能和稳定性进而导致了线粒体代谢障碍,提示线粒体tRNA~(Thr) 15943TC可能与m.1555AG突变引起的耳聋相关。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA的切点在反密码子的G—C键之间。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA 的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA 与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA 的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA 的切点在反密码子的G—C 键之间。     

胰岛素蛋白质工程: [B16Ala]胰岛素和[B26Ala]胰岛素——两个新型的速效人胰岛素

用大动物(猪)降血糖实验证明[B16Ala]胰岛素和[B26Ala]胰岛素是快速降血糖胰岛素. 它们的前体[B16Ala]PIP和[B26Ala]PIP, 在甲醇酵母体系中的分泌表达量分别为650和130 mg/L. 由于它们是新型的分别保留全部和几乎全部胰岛素体内生物活力的速效胰岛素, 且在甲醇酵母表达体系中得到比较高的表达量, 所以具有很好的临床应用前景.     

四核苷酸Ap Gp Ap Gp的合成

本文报道了酵母tRNA~(ala)分子中第42—45核苷酸片段——四核苷酸AGAGp的合成。首先我们化学合成了N,2′,5′-全乙酰化腺苷-3′-磷酸N,N-二甲氨基甲叉鸟苷-3′-磷酸的二环己基码啉胍盐,经DCC缩合、脱保护得到Ap Gp,然后通过氯甲酸乙酯环化形成ApG>p,再经RNaseN_1酶促合成为四核苷酸AGAGp。     

RNA序列测定始末

一、历史的回顾 生物大分子的序列分析,即一级结构的测定,是分子生物学的核心问题,许多科学家为之呕心沥血奋斗终生,取得了巨大成就。 1963年著名的英国科学家Sanger和Thompson揭开了生物大分子序列分析的帷幕,成功的测出了胰岛素51个氨基酸的顺序,获得了1968年诺贝尔奖。1965年Holley等用经典法测定了酵母tRNA~(Ala)的75个核苷酸的全序列。同年Sanger又创造了测定RNA的指纹图谱法,但DNA序列测定的研究工作进展缓慢。     

油菜叶绿体16S rRNA基因前导顺序的一级结构

质粒pBN119的3.2kb BamHI片段的PvuⅡ-BglⅡ片段全顺序长为840bp,其中含油菜叶绿体16S rRNA基因5′端的140bp。通过寻找GTTC顺序,发现在395至468位核苷酸之间是tRNA~(Val)基因;在73至118位核苷酸之间是一个蛋白阅读框。和已发表的玉米叶绿体16S rRNA前导顺序进行比较,同样存在三个相应的大肠杆菌RNA聚合酶的结合位点。和大肠杆菌的启动子及相应基因作比较,表明叶绿体基因组具有很明显的原核性,但其tRNA~(Val)基因没有CCA3′顺序。在16S rRNA基因、tRNA~(Val)基因及蛋白阅读框的5′端附近均能找到一个比较稳定的茎环结构。我们推测这些茎环结构可能和位于反问重复顺序上的某些基因的转录调节有关。     

DIO基因多态性与有氧耐力的相关性研究

目的:研究碘代甲状腺氨酸脱碘酶(DIO)基因多态性与有氧耐力的相关性,寻找与有氧耐力表型相关的分子标记。方法:应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测技术,对123名中国北方汉族优秀长跑运动员(EEA)与127名中国北方汉族普通大学生(CG)DIO1基因C785T位点及DIO2基因的Thr92Ala和Gly3Asp位点进行解析并分析比较,其中优秀运动员又根据运动等级和运动项目分为国际健将与健将组(43vs80),及5/10km和马拉松组(92vs31)。结果:在DIO1的C785T位点及DIO2的Thr92Ala位点,各组间基因型和等位基因频率均无显著性差异(P>0.05);在DIO2的Gly3Asp位点,三种基因型在CG组与国际健将组、CG组与马拉松组间的分布均差异显著(P<0.05),其中TT基因型在CG组中不表达,仅存在于EEA组,但频率很低。DIO2的Thr92Ala及Gly3Asp位点处于强连锁不平衡,CT单体型在男CG组与女CG组、男CG组与男EEA组间分布均差异显著(P<0.05),在男CG组与男健将组、男马拉松组间的分布也均差异显著(P<0.05),TC单体型则在女CG组与女国际健将组、女5000m和10000m组间的分布差异显著(P<0.05)。结论:DIO2基因Thr92Ala及Gly3Asp位点的CT单体型分布具有性别差异,是男子EEA有氧耐力素质的分子标记,可用于男子长跑健将级运动员及马拉松运动员的分子选材,TC单体型则是女子长跑国际健将运动员和5000m、10000m运动员有氧耐力素质的分子标记。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp的合成

以CpGpCpm_2~2G、CpUpCpC、CpUpUpI和Gp为原料,采用T_4RNA ligase催化连接的方法,通过用3′-端带有起保护怍用的磷酸单酯的寡核苷酸作供体(途径A)以及除最后一步外各步都用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体(途径B)的两种途径,都合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp。产率较高。产物的连接点、末端和序列都经过严格鉴定。研究表明,位于受体分子3′-端的稀有嘌呤核苷m_2~2G对T_4RNA ligase催化的连接反应没有不利影响,并再次证实,在用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体进行T_4RNA ligase催化的连接反应时,为了得到高的产率,避免或降低同时产生供体分子的自聚和环化,并不一定需要受体分子大大过量。用本法合成的CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp已用于酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子和全分子的合成中。     

蓖麻蚕后部丝腺体丙氨酸转移核糖核酸的纯化

自从Apgar等(1962)用逆流分溶方法分离纯化酵母丙氨酸转移核糖核酸,并于1965年测定其结构以来,纯化tRNA的方法有了很大的发展(Holly等,1965)。除了少数实验室仍用逆流分溶方法以外,反相层析,BD-纤维素柱,甲基白蛋白柱、羟基磷灰石柱、DEAE-Sephadex柱以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等曾被广泛利用(Letham,1973)。其中,反相层析具有分离效果好,能将一些tRNA的同功受体很好分开的优点,如果配合高压液相层析还可以得到快速分离的效果。自从1971年Pearson等采用RPC-5分离tRNA以来,得到了更广泛的运用。本文报道采用DEAE-Sephadex A-25和RPC-5柱层折,纯化蓖麻蚕后部丝腺体tRNA~(Ala)。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成GpCpm~1ⅠpφpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IpψpGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ipψ为受体,用T_4RNA联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1Ipψ用T_4RNA联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ipψ~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究 Ⅱ.核酸的結构与磷酸解作用

(1) 利用磷酸单酯酶切除商品酵母RNA末端磷酸,可以提高大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶对其磷酸解速度达5—7倍之多,說明大分子核酸和寡核苷酸一样,3′-磷酸末端是妨碍磷酸解的重要因素。(2) 商品酵母RNA,經过脫氨后,磷酸解速度有所提高;說明RNA二級結构的破坏,有利于磷酸解反应的进行。(3) 磷酸解脫氨RNA时,要求較高濃度的Mg~(++)其最适濃度由5×10~(-3)M提高到8×10~(-2)M。(4) 3′-单核甘酸对RNA的磷酸解无影响。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成 GpCpmIpΨpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IppGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ip为受体,用T_4RNA 联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1lp用T_4RNA 联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ip~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p 标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

大肠杆菌tRNASec关键核苷酸位点

在原核生物中,硒蛋白合成需要tRNA~(Sec) (SelC)与硒代半胱氨酸合成(Sec synthase, SelA)、硒代半胱氨酸特异性延伸因子(Sec-specificelongationfactor,SelB)之间相互作用。【目的】基于大肠杆菌掺硒机器,寻找tRNA~(Sec)骨架上关键核苷酸位点,为解决硒蛋白目前面临的掺硒效率较低、产量低的问题提供新思路。【方法】以大鼠细胞质型硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase1,TrxR1)为掺硒模式蛋白为定点突变tRNA~(Sec),转化至BL21 (DE3) gor-获得阳性重组菌株(携带pET-TRSter/pSUABC’),用于表达大鼠硒蛋白TrxR1,然后使用2￠,5￠ADP-Sepharose亲和层析和凝胶过滤两步法分离纯化TrxR1,最后利用经典硒依赖型DTNB还原反应测定TrxR1的酶活,分析关键核苷酸位点,评价掺硒效率。【结果】在存在SECIS元件的前提下,当SelA、SelB、tRNA~(Sec)共表达时,与野生型相比,携带突变型tRNA~(Sec)所共表达的TrxR1酶活力呈现不同程度的降低,其中E.colitRNA~(Sec)的G18、G19这两个位点的所有的TrxR1酶活远低于野生型(10%);然而,a26和b7的酶活相对较高。【结论】E. coli tRNA~(Sec)骨架上G18和G19位点对于维持tRNA稳定性和灵活性发挥了关键作用,位点突变引起tRNA结构变化会影响tRNA~(Sec)与掺硒元件的互作,因此有望通过改造tRNA核苷酸位点来提高硒蛋白的掺硒效率。