凡纳滨对虾DNaseⅠ基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中克隆了DNaseⅠ基因的全长cDNA序列。该序列全长1614bp,包含1209bp的开放阅读框,编码一个含403个氨基酸的蛋白;5′非翻译区为116bp,3′非翻译区为289bp。实时定量PCR分析结果表明,DNaseⅠ基因在肝胰腺的表达量是其他器官表达量的16～162倍,表明凡纳滨对虾DNaseⅠ基因属于胰腺型表达。本研究还利用酶切重组构建原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达出了有活性的重组DNaseⅠ蛋白。     

异色瓢虫HSP67B2基因的克隆及诱导表达分析

小分子热激蛋白是一种重要的分子伴侣,可以在环境胁迫下帮助蛋白质折叠和转运。本研究在转录组获得异色瓢虫 Harmonia axyridis HSP67B2基因部分序列的基础上,通过RACE技术克隆得到了 HSP67B2 基因的 cDNA 全长序列（基因登录号：KJ155728）,全长626 bp,其中编码140个氨基酸,3′非翻译区为 81 bp,5′非翻译区为122 bp,软件分析预测显示该基因编码蛋白的分子量为1597 kD,理论等电点为661。采用荧光定量 PCR 技术对异色瓢虫 HSP67B2基因在不同发育阶段、低温诱导条件和饥饿处理下的表达进行了研究,结果表明：HSP67B2 基因在幼虫期的表达量最高;在低温诱导和饥饿处理下,HSP67B2 基因出现上调表达并且表达效率显著提高,表明HSP67B2 基因可以通过调控小分子热激蛋白的合成使异色瓢虫适应环境变化。      

蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析

利用RT-PCR及RACE技术,克隆到蝴蝶兰1个几丁质酶基因PhCHT(GenBank登录号为KT992851),该基因cDNA全长1 210bp,包含37bp的5′-UTR、933bp开放阅读框和240bp 3′-UTR,编码310个氨基酸;该蛋白为糖苷水解酶第19家族成员,兼具有溶菌酶活性;生物信息学分析显示,该蛋白具N-端信号肽和跨膜结构,为胞外分泌蛋白;该蛋白与海枣、谷子、油棕和拟南芥的几丁质酶类似蛋白相近,并且在系统进化树上与甘蔗和陆地棉的Ⅶ类几丁质酶同属一个分支。PhCHT基因的表达分析表明,PhCHT在蝴蝶兰营养器官和生殖器官中均有表达,根中表达量最高;13℃/8℃低温处理3、6、9和15d时该基因的表达被抑制,4℃低温处理1、2和4h表达量升高。研究表明,PhCHT基因能够响应短期的冷胁迫。研究结果为进一步研究蝴蝶兰几丁质酶的系统进化及抗性育种奠定了基础。     

梨小食心虫几丁质合成酶2基因的克隆与表达研究

【目的】研究梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶2(GmCHS2)基因序列和表达特性,为进一步研究其功能及新型杀虫剂的开发提供理论依据。【方法】利用转录组数据和RACE技术首次获得GmCHS2基因cDNA序列(命名为GmCHS2,GenBank登录号为KY242360),利用其他昆虫同源序列构建系统发育树,利用实时荧光定量PCR技术研究GmCHS2在不同发育阶段和不同组织的表达特性。【结果】GmCHS2基因序列全长4991bp,开放阅读框为4554bp,其中5′端非编码区长267bp,3′端非编码区长170bp,共编码1517个氨基酸,包含了14个跨膜螺旋。系统发育树结果表明该基因属于几丁质合成酶2类基因。GmCHS2基因在试虫不同发育阶段都有表达,预蛹期和成虫期表达量最高;不同组织中,前肠和中肠的表达量最高,其次是后肠,其余组织表达量很少或不表达。【结论】本文研究了GmCHS2基因在梨小食心虫不同发育阶段和组织部位的表达特性,该基因可能在梨小食心虫生长发育过程中具有重要作用。     

池蝶蚌HsPif基因的克隆及表达分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)酸性基质蛋白Pif基因的基本功能,研究通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得了Pif基因的cDNA全长序列,命名为HsPif,其全长为3457 bp, 5′端非翻译区(5′UTR)为485 bp,3′端非翻译区(3′UTR)为363 bp,开放阅读框(ORF)3072 bp,共编码1023个氨基酸,生物信息学分析结果显示HsPif蛋白含有一个von-Willebrand因子A型结构域和三个几丁质结合结构域;氨基酸组成成分结果表明天冬氨酸含量最高,组氨酸含量最低; HsPif蛋白亲水指数为–0.566,为亲水蛋白。构建系统进化树分析显示Pif基因保守性较高,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Pif相似度最高,且与其他贝类在同一个大支上。组织荧光定量PCR结果表明:HsPif基因主要在外套膜中表达;分子原位杂交显示杂交反应主要在外套膜上皮细胞发生。进行植核手术后进行qPCR检测HsPif基因的表达量变化,实验结果表明, HsPif基因可能与珍珠层的分泌有关,有助于进一步了解珍珠形成的机制,为珍珠养殖提供参考。     

异色瓢虫海藻糖合成酶基因的克隆及低温诱导表达分析

海藻糖是昆虫的血糖, 在昆虫体内主要通过海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）催化合成。本研究通过同源克隆和cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE） 技术, 从异色瓢虫Harmonia axyridis中克隆得到了TPS基因的cDNA全长序列, 命名为HaTPS（GenBank登录号： FJ501960）, 全长2 949 bp, 包含3′非翻译区为505 bp, 5′非翻译区为26 bp, 开放阅读框长2 418 bp, 共编码805个氨基酸。软件分析显示该基因编码蛋白的分子量为90.58 kD, 等电点为7.01, 包含两个糖基化位点, 无信号肽和跨膜结构。同源比对分析发现, 昆虫中TPS基因高度保守, 包含两个保守的结构域。同时, 采用实时荧光定量PCR技术对异色瓢虫HaTPS在不同发育阶段、 低温诱导条件下的表达量进行了研究。结果表明： HaTPS在预蛹期的表达量最高; 在短时低温诱导条件下, HaTPS的表达量随着温度的降低而显著升高, 在降温和升温处理条件下, HaTPS的表达量呈现先升高后下降的表达趋势。结果表明, TPS基因在昆虫抗逆中起到了重要的调节作用。昆虫经过低温诱导, 其TPS基因的调控能力得到提升。     

小黑杨环锌指蛋白基因的克隆与表达分析

用cDNA-AFLP技术从小黑杨中克隆与盐胁迫反应相关的cDNA片段,进一步应用RACE技术克隆出具有完整开放读码框的小黑杨环锌指蛋白基因（PsnRZF）,该基因全长1061bp,其中5非翻译区为184bp,3非翻译区为82bp,开放读码框为795bp,编码264个氨基酸,预测蛋白的分子量为30.25kDa,理论等电点为8.04。实时定量PCR检测的结果显示,正常生长条件下该基因在根、茎、叶中都表达;NaCl胁迫下,该基因在根、茎、叶中的表达量升高。在叶中的表达量随着处理时间的延长而逐渐升高,胁迫处理后第6天表达量达到最高。     

油菜BnHMGB2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的BnHMGB2基因的cDNA,全长823 bp,其中包括438 bp的开放阅读框,131 bp的5′非翻译区（5′UTR）,253 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与拟南芥AtHMGB2的同源性达到了87.4%,因此命名为BnHMGB2(GenBank登录号：JN807314)。该基因编码145个氨基酸的蛋白质,分子量15.9 KDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR结果表明该基因在油菜根、茎、叶、下胚轴均有表达,根中表达量最高。同时,该基因的表达受低温胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

棉铃虫BR-C Z1基因的克隆及表达谱分析

广泛锌指复合物(BR-C)在棉铃虫Helicoverpa armigera的生长发育过程中有重要作用。基于转录组数据通过PCR克隆获得棉铃虫BR-C Z1(HaBR-C Z1)基因序列,利用生物信息学分析其氨基酸序列,利用qRT-PCR分析基因的表达规律,以及2-十三烷酮(2-TD)处理后基因的表达情况。结果显示,HaBR-C Z1基因的开放阅读框长1 284 bp,编码427个氨基酸,预测编码蛋白的分子量和等电点分别为47.41 kD和7.72。系统进化树显示,HaBR-C Z1与帝王斑蝶Danaus plexippus plexippus的亲缘关系最近。HaBR-C Z1基因在预蛹期和6龄幼虫肠组织中的相对表达量最高。20 mg·g^-1浓度2-TD处理后的相对表达量在6 h达到峰值,为对照组的24.7倍。本研究明确了HaBR-C Z1基因的表达规律及其对2-TD的响应,为深入了解棉铃虫生长发育机制奠定了基础,并为害虫防治提供依据。     

朱砂叶螨几丁质合成酶基因1全长cDNA的克隆与表达分析

【目的】克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质合成过程中的关键酶几丁质合成酶基因,并检测该基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【方法】本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及c DNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆获得朱砂叶螨几丁质合成酶基因1的全长c DNA序列(命名为Tc CHS1,Gen Bank登录号为KM242062),并使用实时荧光定量PCR技术首次检测了Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【结果】朱砂叶螨Tc CHS1基因的c DNA全长为4 881 bp,包括198 bp的5'非翻译区(5'-UTR),4 425 bp的开放阅读框(ORF),258 bp的3'非翻译区(3'-UTR),开放阅读框编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.35 ku,理论等电点为6.26。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。氨基酸序列同源性分析结果表明:Tc CHS1与其他昆虫该基因编码蛋白的氨基酸序列相似度在50%左右,与二斑叶螨Tetranychus urticae的氨基酸相似度最高(98%),与西方盲走螨Metaseiulus occidentalis的相似度为55%。分子系统进化的结果也表明Tc CHS1与其他昆虫的CHS1聚在一起,并且和二斑叶螨具有最近的亲缘关系。荧光定量分析表明Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育的不同阶段(卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨)均有表达,在卵和雌成螨中的表达量较高,在第2若螨的表达量最低。【结论】Tc CHS1基因可能在朱砂叶螨生长发育过程中具有重要作用。     

虹鳟spindlin基因克隆及不同倍性的表达分析

spindlin基因是减数分裂纺锤体相关因子,为了研究spindlin基因在二倍体和三倍体雌性虹鳟减数分裂过程中出现的差异,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得spindlin基因cDNA 4529 bp(GenBank登录号:MN378564),其中3′非编码区(UTR)和5′非编码区(UTR)分别长3662 bp和141 bp,开放阅读框(ORF)长726 bp,编码241个氨基酸,该蛋白质序列的相对分子量为28.3 kD,理论等电点值为5.94,无跨膜结构。同源性分析表明,虹鳟(Oncorhynchus mykiss)与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高,高达99.59%。系统发育进化树显示,虹鳟与大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)和红点鲑(Salvelinus alpinus),聚为一支。实时荧光定量(RT-PCR)结果显示, spindlin基因在二倍体雌性虹鳟卵巢、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠和鳍组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。对于二倍体雌性虹鳟,在受精后24...     

中华鳖组蛋白H2A变体克隆及其在卵母细胞中的表达分析

为研究组蛋白H2A对龟鳖动物生殖细胞发育分化作用和机制,克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)组蛋白H2A变体的同源物(命名为PsH2A),分析其转录本的表达模式及在卵巢发育成熟过程中的细胞定位。PsH2A cDNA序列全长575 bp, 5′端非编码区68 bp, 3′端非编码区108 bp,开放阅读框399 bp,编码133个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示其与龟类的H2A变体同源性更高,与哺乳类同源性较低。RT-qPCR和RT-PCR结果显示,PsH2A转录本在1冬龄、2冬龄和3冬龄的中华鳖卵巢中高表达(P<0.01),而在精巢和其他成体组织中几乎检测不到。化学原位杂交结果显示, PsH2A mRNA在卵母细胞中特异性表达,其中初级卵母细胞中表达信号最强,且均匀的分布在细胞质中。随着卵母细胞发育成熟进入到生长期和成熟期后,目的信号逐渐减弱,并且主要在核周区域表达。此外, PsH2A mRNA的相对表达量也表现出中华鳖卵巢发育的季节性变化。综上,研究结果表明PsH2A在中华鳖卵母细胞发育过程中可能发挥着重要作用。     

棉铃虫活化的蛋白激酶C受体1(RACK1)基因的分子鉴定

活化的蛋白激酶C受体l(receptor for activated C kinase1,RACKl)广泛分布于真核生物和原核生物中,在生物体内具有极其重要的调节功能。本实验利用RT-PCR和RACE的方法扩增获得了棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)RACK1基因全序列,序列分析结果表明,该基因开放阅读框为957bp,编码319个氨基酸残基。5'端非编码区长为36bp,3'端非编码区长为112bp。发育时相表达发现RACK1基因在棉铃虫的蜕皮时期大量表达,进一步的激素处理实验发现,蜕皮激素诱导RACK1基因表达,保幼激素和饥饿抑制RACK1基因表达。这些研究结果为进一步研究RACK1基因的功能奠定基础。     

赤眼鳟Mx1基因的cDNA克隆及表达特性

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)是否存在Mx1 (Myxovirus resistance)基因及参与抗病毒免疫反应, 研究利用RACE技术获得了赤眼鳟Mx1基因(ScMx1)的cDNA全长序列, 并对其进行了生物信息学分析; 采用荧光定量PCR技术, 检测了ScMx1在赤眼鳟健康组织中的表达情况以及感染GCRV后ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达特征。结果表明, ScMx1的cDNA全长为3000 bp, 包含5′非编码区124 bp, 开放阅读框1893 bp, 3′非编码区983 bp, 共编码630个氨基酸。预测的ScMx1蛋白包含GTP酶结合区域、中央核心结构域和GTP酶效应结构域。ScMx1与青鱼Mx1的相似性最高(97%), 与ScMx的相似性仅为50%。ScMx1在所检测的10种组织中均有表达, 其中在脾脏中表达量最高。经GCRV感染开始至168h, ScMx1和ScIFN-Ⅰ在肝脏和体肾中的表达量持续上调; 在脾脏和头肾中于感染后72h达到峰值。相关性分析显示脾脏中ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达水平呈显著相关(r=0.94, P=0.018)。研究发现赤眼鳟存在Mx1基因, 且可能参与了抗GCRV免疫应答反应。     

定虫隆对锈赤扁谷盗生长发育影响及其作用机理初探

定虫隆是一种昆虫生长调节抑制剂,研究其对锈赤扁谷盗的控制作用,将为锈赤扁谷盗的综合防治提供理论基础。本研究以锈赤扁谷盗幼虫为研究对象,用定虫隆拌粮进行饲喂,观察定虫隆对锈赤扁谷盗的亚致死效应,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,测定经定虫隆处理后锈赤扁谷盗幼虫几丁质合成酶1(CfCHS1)和几丁质合成酶2(CfCHS2)基因表达量的变化。结果表明:定虫隆对锈赤扁谷盗的毒力回归方程为y=7.514+1.81x(r=0.974),LD 10、LD 20、LD 30分别为0.008 mg/kg、0.014 mg/kg、0.021 mg/kg,亚致死剂量定虫隆可使锈赤扁谷盗幼虫发育历期明显延长(P<0.05),体重和几丁质含量明显降低(P<0.05),这说明了定虫隆对锈赤扁谷盗的生长发育有明显的抑制作用,可以有效控制锈赤扁谷盗的为害。qPCR结果显示,与对照组相比,LD 30处理后的锈赤扁谷盗幼虫的CfCHS 1基因表达量提高了74.7%,CfCHS 2基因的表达量提高了27.4%,均差异显著(P<0.05)。CfCHS 1和CfCHS2基因表达量的上调,可能是几丁质合成酶受到了抑制,锈赤扁谷盗为了维持机体的稳定,提高几丁质合成酶基因的表达量,从而形成一种代偿性增加的反馈机制,由此推测定虫隆可能作用于几丁质合成酶。     

紫色马铃薯类黄酮3，′5′-羟化酶基因（StF3′5′H）的克隆及分析

类黄酮3′,5′羟-化酶（ flavonoid 3′,5′-hydroxylase, F3′5′H）是植物花青素生物合成途径中的一个关键酶,紫色土豆（ Solanum tueb or sum） F3′5′H基因的克隆将为花青素合成调控和花青素代谢工程研究提供优质基因资源。研究采用RACE技术克隆了紫色土豆F3′5′H基因的cDNA全长序列,用生物信息学方法对其核苷酸和蛋白质序列进行了分析,并用半定量PCR 技术分析了F3′5′H基因在不同组织中的表达情况,同时研究了赤霉素和蔗糖处理后F3′5′H基因表达与花青素积累之间的相关性。研究结果表明,克隆的紫色土豆F3′5′H的cDNA全长为1854 bp,包含一个1530 bp的完整ORF,共编码509个氨基酸。生物信息学分析表明,StF3′5′H基因推测编码的氨基酸序列与其它植物的F3′5′H蛋白的相似性很高。 StF3′5′H基因的表达具有组织特异性,在紫色土豆根、茎和叶柄中都有表达,其中在叶柄中表达最强,而在块茎、叶轴和叶片中几乎检测不到StF3′5′H基因的表达。赤霉素和蔗糖能促进紫色土豆StF3′5′H基因的表达,进而促进花青素的积累。     

Sexually dimorphic expression and regulatory sequence of dnali1 in the olive flounder Paralichthys olivaceus

Dynein axonemal light intermediate chain 1 (dnali1) is an important part of axonemal dyneins and plays an important role in the growth and development of animals. However, there is little information about dnali1 in fish. Herein, we cloned dnali1 gene from the genome of olive flounder (Paralichthys olivaceus), a commercially important maricultured fish in China, Japan, and Korea, and analyzed its expression patterns in different gender fish. The flounder dnali1 DNA sequence contained a 771 bp open reading frame (ORF), two different sizes of 5′ untranslated region (5′UTR), and a 1499 bp 3′ untranslated region (3′UTR). Two duplicated 922 nt fragments were found in dnali1 mRNA. The first fragment contained the downstream coding region and the front portion of 3′UTR, and the second fragment was entirely located in 3′UTR. Multiple alignments indicated that the flounder Dnali1 protein contained the putative conserved coiled-coil domain. Its expression showed sexually dimorphic with predominant expression in the flounder testis, and lower expression in other tissues. The gene with the longer 5′UTR was specifically expressed in the testis. The highest expression level in the testis was detected at stages IV and V. Transient expression analysis showed that the 922 bp repeated sequence 3′UTR of dnali1 down-regulated the expression of GFP at the early stage in zebrafish. The flounder dnali1 might play an important role in the testis, especially in the period of spermatogenesis, and the 5′UTR and the repetitive sequences in 3′UTR might contain some regulatory elements for the cilia.