一种快速mRNA差异显示技术及用于分离辐射诱导转录子

介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速ｍＲＮＡ差异显示技术。其特点是不用 位素标记操作简便,在普通琼脂糖凝胶电泳中就能分辨差异显示的ｃＤＮＡ带,便于ＤＮＡ回收和进一步重组克隆。用此方法成功地分离到电离辐射诱导转录子。     

降低mRNA差异显示技术假阳性率的一种方法

为了探讨降低mRNA差异显示技术假阳性率的方法 ,进一步提高此技术的可靠性 ,提取了手术切除肝癌及非癌肝组织成对标本的总RNA ,逆转录获得cDNA片段 ,以mRNA差异显示方法筛选差异表达基因 ,选取较明显的一条差异表达条带 ,行进一步PCR扩增 .分别对PCR产物及其经TA克隆后随机挑选的 6个单克隆质粒DNA进行序列分析 ,并通过GenBank BLAST数据库进行序列的同源性比较 ,以Northern杂交予以来源确认 .自 72 0余条扩增条带中共选出 2 8条差异条带 .序列分析及同源性比较表明 ,所选择条带的PCR产物为一可能的新基因片段 ;而随机选择的 6个TA克隆质粒DNA中 ,有 4个为同一已知基因片段 ,一个为另一已知基因片段 ,一个为一可能的新基因片段 .同源性比较表明 ,PCR产物直接测序所得序列与TA克隆质粒DNA的 6个片段不具同源性 .结果表明 ,mRNA差异显示条带可能由 1条以上分子量相似的片段构成 ,直接对PCR产物行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,是导致出现假阳性片段的原因之一 .将PCR产物进行TA克隆 ,对单克隆质粒DNA进行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,可能是解决此问题的一种较好方法 .     

mRNA差异显示

分离差异表达的基因是研究生命调节过程的重要手段,mRNA差异显示技术是一种能成功分离差异表达基因的方法,文章对该方法的基本原理、方法步骤及其应用作了较为详细的介绍。     

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法,通过选用3’锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合,以琼脂糖凝胶电泳,EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,对低温处理草菇（Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合RNA斑点杂交技术加以验证,分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。     

利用mRNA差异显示技术研究香菇发育相关基因

以香菇子实体不分化突变株和对照菌株L98411为材料,利用mRNA差异显示技术研究二者的基因表达差异,共分离到21条差异片段,其中12个分别与泛素、ATP合成酶、锌指蛋白、GTP结合蛋白、延伸因子g1线粒体前体、过氧化物酶、硫酯酶、类TrpB酶、2,4-二烯酰辅酶A还原酶、糖苷水解酶、热激蛋白、疏水蛋白等已知基因有较高的同源性,这表明香菇子实体分化发育是一个复杂的过程,涉及到胞内转运、转录调控、细胞分化、蛋白合成、各种代谢途径中的酶、抗逆反应等诸多途径的协同调控。     

mRNA差异显示技术克隆中国葡萄属野生种核糖体RNA基因

克隆功能基因是研究植物基因结构及功能的重要途径,利用mRNA差异显示技术,筛选获得了中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1在人工接种白粉菌前后差异表达基因的cDNA片段Vprdrf4。经Northern杂交验证,该片段为正调控片段,Blaset检索表明与真核生物核糖体RNA基因的同源性高达90%以上,GenBank登录号为CD347664。     

mRNA差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用

动物从卵裂开始的早期胚胎发育始终伴随着mRNA不断的合成与降解。最初受着受精卵内母体mRNA的控制。当这些mRNA在发育过程中逐渐被降解时,有些动物（如小鼠）在比较早的时期已有新的基因的转录;而有些动物（如鱼类、两栖类）迟到囊胚中期以后,合子核的基因才开始转录新的mRNA。mRNA这各肯规律的代谢活动控制着细胞的分化、层的形成以及模式形成（pattem formation)。所有这些mRNA水平上的变化都可以用mRNA差异显示法（mRNA differential displsay)检测出来并进而获得与早期胚胎发育有关的基因。mRNA差异显示法是由Liang和Psardee于1992年建立起来的,用于显示两种不同组织之间mRNA差异的方法。基于绝大多数mRNA有一个poly(A)尾巴,选用一个较特殊的3’端引物－5’T11MN3’,其中M可以是dATP,dCTP,dGTP之一,而N可以是dATP,dTTP,dGTP之一,进行逆转录时,1／12的RNA可被逆转录为cDNA。这种cDNA第一链被用来PCR扩增,所使用的3’端引物与逆转录引物相同,而5’端引物为10个碱基的一个寡核苷酸,这类任意（aritrary)引物共有26种。这样,当我们利用一对引物进行RT－PCR时,1／312（12X26＝312）的mRNA可以被显示出来。将来自不同发育阶段胚胎的总RNA的RT－PCR产物在6％的聚丙烯酰胺变性胶上平等走电泳、放射自显影后即可知道胚胎之间在mRNA水平上的差别,然后从cDNA文库中钓取全长的cDNA或从基因文库中筛选完整基因并对其序列、结构、功能等方面进行研究,从而揭示不同发育阶段胚胎间性状上差异的根源。mRNA差异显示技术已在小鼠、大鼠、斑巴鱼、抓蟾等动物的早期胚胎发育基因的研究中得了应用,取得了较好的结果。     

克隆未知基因的新方法——mRNA差异显示技术

高等生物大约有１０万个不同的基因,但只有１５％的基因在任何个体的细胞中都表达。选择哪个基因表达决定了生命历程中的许多重要环节,如：细胞的发育、分化、应激、细胞周期调节、衰老和细胞凋亡。因此,对不同类型、不同时期细胞的基因表达情况进行比较研究,可以获得...     

mRNA差异显示技术及其应用

mRNA差异显示技术是国外最近发展起来的一种分离表达水平出现差别的基因的新技术。目前已广泛用于人类及其他动物生长发育基因调控、基因克隆研究,也开始用于植物基因分析、杂种优势机理等方面研究。本文综述这一新技术原理、实验步骤、应用及问题与展望。     

mRNA差异显示RT-PCR技术在昆虫学研究中的应用

mRNA差异显示RT- PCR是近 1 0年广泛使用的用于克隆和分析差异表达基因的有效技术。该文简要介绍了差异显示RT -PCR技术的原理、优缺点及其优化方法 ,重点综述了mRNA差异显示RT -PCR技术在昆虫学研究中的应用。     

差异显示技术及其进展

差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的ｍＲＮＡ进行分组反转录及ＰＣＲ扩增,在相邻泳道上显示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异。差异显示技术建立至今仅五年时间便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床诊断遗传疾病等方面被广泛应用,并不断得到改进和完善。     

真核生物mRNA差显技术(Differential Display)的研究进展

真核生物ｍＲＮＡ差显技术（ＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙ）的创立及其对该技术的一系列改进,为研究与生殖、发育、细胞分化、癌变、病变、衰老、程序化死亡及抗逆性与抗病性等生命过程有关的基因的差异表达,以及有关基因的分子克隆提供了有效工具。本文简要概述差显技术的原理、优越性、主要缺陷、技术改进等方面的研究进展。     

Bt Cry1Ac抗性粉纹夜蛾离体细胞与敏感细胞mRNA的差异显示

为了研究昆虫对Bt的抗性机制 ,以苏云金芽孢杆菌Cry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾离体细胞连续筛选 80代 ,获得了高抗性细胞。采用DDRT PCR技术比较了该抗性细胞与非选择敏感细胞mRNA的差异 ,经反向RNA斑点印迹杂交确证了 5个片段为两种细胞的显著差异表达序列标签(ESTs)。序列分析结果表明 ,敏感细胞特有的三种ESTs都位于cDNA的非编码区 ,两种ESTs(GenBank注册号 :S1 ,CF32 2 4 1 5 ;S3,CF32 2 4 1 7)与数据库中EST没有显著同源性 ,另一种S2(GenBank注册号 :CF32 2 4 1 6)与已登录的某些昆虫的ESTs具有一定的同源性。从抗性细胞特有的R1 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 3)推导出的氨基酸序列与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶有 60 %～63%的同源性 ,从抗性细胞特有的R2 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 4)推导出的氨基酸序列与黏蛋白类有约 30 %的同源性。这些差异表达基因可能与抗性的形成相关。     

mRNA差别显示技术在植物发育研究中的应用

mRNA差别显示技术是近年发展起来的研究基因表达差异的有效方法,它不仅可比较基因表达差异、追踪已知基因的表达情况,而且可作为寻找特异表达基因的重要手段。本文介绍此方法在植物春化作用、光周期反应、花发育、雄性不育、成熟、衰老、种子发育和休眠及根发育等研究领域的应用概况。     

六种回收纯化差异显示PCR产物方法的比较

目的:建立mRNA差异显示PCR产物回收纯化方法。方法:采用了6种方法对干旱东亚砂藓mRNA差异显示技术的特异PCR产物进行分离回收纯化。结果:6种不同回收方法,显示不同的结果。结论:冻融法简单、方便、经济、有效,对东亚砂藓构建的mRNA差异显示技术中特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较

目的：建立简化的mRNA差异显示技术中特异条带的回收方法。方法：用单个小鼠早期发育的胚胎构建mRNA差异显示技术,用一步法和煮沸法分别从银染的聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的特异条带,并进行再扩增、回收、克隆及酶切鉴定。结果：两种不同的回收方法经过mRNA差异显示技术程序环节,证明其具有相同的实验效果。结论：应用简化的一步法和煮沸法对单胚构建的mRNA差异显示技术中的特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

利用mRNA差别显示技术分离盐胁迫下红树植物白骨壤耐盐相关cDNA

从福建龙海红树林自然保护区采集白骨壤的隐胎生果实 ,在实验室分别置于 0‰盐度海水和 50‰盐度海水进行沙培。分别取叶片 ,提取纯化RNA。通过锚定引物OligodT₁₂ GC反转录和 8个 10核苷酸随机引物进行PCR扩增 ,经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了 3个差异DNA片段只在高盐培养条件的白骨壤基因组中表达 ,而在无盐培养条件中没有出现。这 3个差异cDNA片段分别命名为csrg1(600bp)、csrg2(550bp)、csrg3(480bp)。3个差异cDNA片段的RNA杂交结果显示 ,只有csrg1片段存在明显差异 高盐中有杂交斑点 ,无盐中无杂交斑点 ;而其余 2个片段在高盐和无盐条件下都没有杂交斑点出现。从而表明csrg1就是耐盐相关cDNA。进一步将csrg1片段克隆 ,并进行DNA序列分析。全序列在GenBank中查询后 ,未发现相关同源片段。耐盐相关cDNA片段的获得 ,将为分离全长耐盐基因 ,搞清该基因表达调控的机理提供条件.     

Assessment of ER Stress and Autophagy Induced by Ionizing Radiation in Both Radiotherapy Patients and Ex Vivo Irradiated Samples

Acute radiation leads to several toxic clinical states and triggers some molecular pathways. To shed light on molecular mechanisms triggered by ionizing radiation (IR), we examined the expression profiles of endoplasmic reticulum (ER) stress and autophagy‐related genes in individuals who were exposed to IR. Blood samples were collected from 50 cancer patients before radiotherapy and on the 5th, 15th, and 25th days of the treatment. Peripheral blood samples from 10 healthy volunteers were also obtained for ex vivo irradiation, divided into five and irradiated at a rate of 373 kGy/h to 0, 0.1, 0.5, 1, and 3Gy γ‐rays using a constant gamma source. GRP78, ATG5, LC3, ATF4, XBP1, and GADD153 genes were analyzed by quantitative real‐time polymerase chain reaction (QRT‐PCR) using beta 2 microglobulin (B2M) and glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase (GAPDH) as references. In both groups, expressions of the selected genes have increased. It can be concluded that IR induces ER stress and related authophagy pathway in the peripheral lymphocyte cells proportionally by dose.