3-MA增强鼻咽癌细胞对Polo样激酶抑制剂敏感性的机制研究

鼻咽癌高发于东南亚地区及中国南部省份,在鼻咽癌晚期治疗中细胞周期类化疗药物多有应用, Polo样激酶抑制剂是一类新型的具有一定应用前景的细胞周期类化疗药物。该研究以鼻咽癌细胞5-8F、6-10B为模型对Polo样激酶1(Polo like kinase 1, PLK1)抑制剂的应用进行初步探索,通过Cell Counting Kit-8实验、流式细胞术发现PLK1抑制剂GW843682X、BI2536与选择性磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)联合使用可显著增强PLK1抑制剂对鼻咽癌细胞的增殖抑制,并诱导更多的鼻咽癌细胞死亡;综合细胞周期及凋亡蛋白的检测结果,认为3-MA可通过促进细胞周期蛋白依赖性激酶1/周期蛋白B1(cyclindependent kinase 1/cyclin B1, CDK1/Cyclin B1)复合物的激活增强Polo样激酶抑制剂对鼻咽癌细胞的杀伤能力。综上所述, 3-MA可作为PLK1抑制类药物的增敏剂,增强其对鼻咽癌细胞的抑制效果,该研究为相关药...     

Polo样激酶1功能及其在肿瘤靶向治疗中的应用

Polo样激酶1(polo-like kinase1,PLK1)是一种广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸激酶,在细胞周期调控中发挥关键的作用。其主要功能包括参与激活cyclin B/CDK1复合体,协助中心体的功能成熟,活化细胞分裂后期促进复合物(anaphase promoting complex,APC),促进染色体正常分离、分配和调控胞质分裂等。现已发现PLK1在多种肿瘤中表达增高并与某些肿瘤的预后密切相关。利用反义寡核苷酸、RNA干扰技术和化学合成PLK1小分子抑制剂等方法阻断PLK1的表达或降低其激酶活性,能够有效抑制肿瘤细胞的增殖并介导肿瘤细胞的凋亡,但对正常细胞没有明显影响,因此PLK1在肿瘤靶向治疗中具有重要的应用前景。     

Polo样蛋白激酶4的研究进展

Polo样蛋白激酶4(Polo-like kinase 4,PLK4)为Polo样蛋白激酶家族的成员之一,是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PLK4主要在分裂活跃的组织和细胞中表达,可能是中心粒复制的主要调控因子之一,在中心粒的复制过程中起关键作用。此外,PLK4与肿瘤发生、发展有着密切的联系。本文主要就PLK4近几年的研究进展作一综述。     

Polo样激酶1抑制剂Rigosertib对细胞放射损伤的防护作用

DNA双链断裂是电离辐射诱发最严重DNA损伤,能启动细胞周期阻滞、修复和死亡系列信号反应,其中周期阻滞是DNA损伤应答的重要过程,为DNA损伤修复提供了充足的时间。周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinase 4/6,CDK4/6)、周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase1,CDK1)和Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)等是细胞周期调控关键激酶,其抑制剂可以阻滞细胞周期进程,是否具有细胞放射防护作用有待进一步探究。本文选择人宫颈癌细胞HeLa、人正常乳腺细胞MCF-10A以及人脐静脉上皮细胞HUVEC为研究对象,研究比较了PLK1抑制剂Rigosertib、Volasertib, CDK4/6抑制剂Palbocilib, CDK1抑制剂Ro-3306的辐射防护作用。流式细胞术检测表明,Rigosertib、Volasertib、Ro-3306将细胞阻滞于G₂期(P<0.05,P<0.01或P<0.001),Palbocilib将细胞阻滞于G₁     

人Polo样激酶1活性缺失突变体和结构域在293细胞中的瞬时表达

目的:构建人Polo样激酶1(Plk1)活性缺失突变体及结构域突变体的真核表达载体,并在293细胞中表达。方法:用二次PCR方法扩增Plk1基因并点突变,将82位赖氨酸突变为精氨酸,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;用普通PCR方法扩增Plk1激酶区域及Polo盒区域(PBD)基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;将上述质粒转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达。结果:构建了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD真核表达质粒,在293细胞中均可有效表达,蛋白相对分子质量分别为68×103、45×103、31×103。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD蛋白,有助于进一步探究Plk1对底物的功能。     

保罗样激酶1保罗盒结构域: 肿瘤治疗的新靶标

保罗样激酶1（Polo-like kinase 1, Plk1）与恶性肿瘤的发生与发展密切相关,被认为是肿瘤分子靶向治疗中最具潜力的重要靶标之一。目前,针对Plk1激酶结构域（Kinase domain, KD）设计Plk1抑制剂已成为研究热点,其中部分小分子抑制剂已进入Ⅰ/Ⅱ期临床研究并展现出良好的抗癌前景。尽管Plk1 KD结构域抑制剂具有一定的靶标选择性,但鉴于作为ATP结合口袋的KD结构域在众多激酶结构中的高度保守性和易导致交叉耐药等问题,这使开发高选择性的Plk1 KD结构域抑制剂面临极大的挑战。保罗盒结构域（Polo-Box domain, PBD）作为Plk1特有的底物结合域,在调控Plk1的亚细胞定位中具有重要功能,被认为是未来高选择性Plk1抑制剂开发的理想靶标。文中对Plk1 PBD的分子结构、生物学功能和相关抑制剂的研究进展进行了综述和展望,以期为靶向Plk1 PBD结构域抑制剂的分子设计提供有益的借鉴和参考。     

PLK1基因沉默抑制HeLa细胞凋亡

以高表达Polo样激酶1（Polo-like kinase 1,PLK1）的宫颈癌细胞系HeLa细胞为模型,观察针对PLK1基因的短发夹状RNA（short hairpin RNA,shRNA）对其凋亡和增殖的影响.设计并合成了针对PLK1的shRNA,将其导入构建的携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的RNAi（RNA interference）表达载体中.通过 RT-PCR和Western 印迹分别检测HeLa细胞PLK1基因和蛋白水平的表达,以流式细胞仪和PI-Hochest双染法测细胞凋亡,MTT法检测细胞的增殖水平.成功构建了携带EGFP的RNAi表达载体pEGFP-H1.转染shRNA后,HeLa细胞PLK1的表达降低至30%.与对照组和空载体转染组相比,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,其增殖活性则明显降低.本课题构建的RNAi表达载体便于观察靶基因的转染情况,且不影响H1启动子的体内转录.PLK1的基因沉默能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,有可能为未来肿瘤的治疗找到新的靶点和有效途径.     

Bora在细胞功能调控中的作用和机制研究进展

Aurora蛋白激酶A及Polo样蛋白激酶1（PLK在）作为重要的细胞周期调节蛋白可参与调控纺锤体组装、有丝分裂等细胞进程,但其激活机制及在有丝分裂中的作用机制仍然不是很清楚。Bora作为Aurora蛋白激酶A的结合蛋白,在果蝇和脊椎动物中功能高度保守,其主要通过结合Aurora蛋白激酶A从而调节Aurora蛋白激酶A的活性、促进PLK1的磷酸化、调节纺锤体的组装以及调控细胞周期进程等。随着对Bora研究的深入,人们对AuroraA和PLK1的激活机制以及Bora、Aurora蛋白激酶A、PLK1三者对细胞的调控也有了进一步的认识。主要综述Bora在细胞功能调控中的作用和研究机制。     

国外研究信息

<正>白细胞介素1受体相关激酶1旁路引发和直接连接Toll样受体至快速核苷酸结合寡聚化结构域样受体含热蛋白结构域3炎性体激活致病性感染和组织损伤引发炎性体的组装,这种胞质蛋白复合物激活半胱天冬酶-1(caspase-1),促进白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和pro-IL-18的切割成熟,还能调节caspase-1依赖的程序性细胞死亡(pyroptosis)。众所周知,微生物识别Toll样受体(TLR)主要是诱导激活caspase-1,但已知的TLR功能仅限于上调炎性体的作用。感染致命微生物后,TLR和核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)有可能同时     

多功能的Ⅰ型跨膜蛋白ESDN

内皮和平滑肌细胞来源的neuropilin样分子ESDN(endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like molecule)是在哺乳类动物中广泛存在的一类I型跨膜蛋白(type-I transmembrane protein)。ESDN由N-端长分泌信号序列、一个CUB(domain found in complement C1r/C1s、Uegf和Bmp1)结构域、一个LCCL(domain found in Limulus factor C、Coch和Lgl)结构域、一个凝血因子V/VIII同源结构域和一个长胞质尾部组成,在生物进化过程中相对保守。该文综述了ESDN蛋白的发现与分布及其结构特征,对ESDN参与血管再生调控的研究成果进行了较为详细的综述,同时介绍了ESDN在肿瘤发生、转移及免疫等方面作用的研究进展。     

受体相互作用蛋白激酶3的病理生理学作用及研究进展

受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)是受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,可通过RIPK1-RIPK3-混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain like protein,MLKL)途径或钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)介导坏死性凋亡,进而调节炎症反应和氧化应激,在心脏、脑、肝脏、肾脏等损伤和病毒感染中发挥重要作用。多种化合物可抑制RIPK3或者坏死性凋亡,具有潜在的临床应用前景。本文系统综述了RIPK3的病理生理学作用及相关研究进展。     

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)SAM结构域对激酶结构域的脂质体结合能力与激酶活性的调控研究

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph receptor) 是受体酪氨酸激酶(RTK)家族中最大的亚家族,其介导的双向信号传导对细胞的形态、黏附、运动、增殖、生存及分化都有重要的调控作用。EphA2是Eph受体家族中一个被广泛研究的重要亚型,在白内障和乳腺癌等病理发生过程中发挥了重要作用。既往研究发现:EphA2受体的激酶结构域可结合细胞膜,其激酶活性受磷脂膜的调控,但是相邻的SAM结构域对激酶结构域与脂膜的相互作用以及激酶活性的影响尚不清楚。在此项研究中,通过与磷酸酶PTP1B1-301活性片段共表达的方式,表达、纯化了EphA2受体的胞内段激酶-SAM串联结构域,通过比较胞内段激酶-SAM串联结构域与单独激酶结构域的脂质体结合能力,以及测定对应的激酶活性,发现:EphA2受体胞内段的SAM结构域使其激酶结构域与脂质体(4 mg/mL)的结合能力增强约6倍(P＜0.001);磷酸化后的EphA2胞内段激酶-SAM串联结构域结合脂质体(4 mg/mL)的能力比非磷酸化的胞内段激酶-SAM串联结构域提高2.5倍(P＜0.05);而结合脂质体后,激酶结构域的激酶活性也被进一步提高,从而形成正反馈。综上所述,本研究的发现提示:EphA2胞内段的酪氨酸激酶结构域与相邻的SAM结构域可形成一个完整的结构功能单位,其激酶活性和脂质体结合能力与单独的激酶结构域相比都形成了明显的差异,我们的这一发现对进一步理解Eph受体家族其他亚型的激酶结构域的活性调控提供了参考与思路。     

PLK3在前列腺癌细胞中的表达与定位

据报道,Polo样蛋白激酶3(polo-like kinase 3,PLK3)具有促进前列腺癌细胞的生长增殖及迁移能力。本研究旨在构建pCDNA3-FLAG-PLK3真核表达质粒,初步探究其在前列腺癌细胞系内的表达与定位,并检测前列腺癌细胞系中的内源PLK3蛋白水平。根据PLK3蛋白的编码序列设计合成PLK3蛋白编码序列的引物,以含有PLK3蛋白编码序列的质粒作为模板,并通过PCR扩增目的片段,再用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切、连接并转化后,挑取单克隆菌落扩增并提取质粒,进行双酶切鉴定以及测序比对。将序列比对正确的重组质粒转染至CWR22Rv1及LNCaP细胞中,利用Western Blot实验检测重组质粒在CWR22Rv1和LNCaP细胞中的表达;以免疫荧光染色实验检测外源的FLAG-PLK3蛋白在细胞中的定位。此外,利用Western Blot实验检测了在五种前列腺癌细胞系中内源PLK3蛋白水平。本研究经过以上实验构建出了FLAG-PLK3真核表达质粒,并且验证其能够在前列腺癌细胞中表达;通过免疫荧光确定FLAG-PLK3蛋白在细胞中主要分布在细胞膜中,少量分布在细胞...     

NLRP10蛋白的结构和自组装

NLRP10是NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)蛋白家族的特殊成员,它具有N端热蛋白结构域(pyrin-like domain,PYD)和中间的核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain,NOD),却不具有亮氨酸富集重复结构域(leucine-rich repeat domain,LRR),这表明NLRP10可能并不直接参与病原微生物的识别,而是行使免疫调节的功能.研究表明,NLRP10能促进NOD1介导的免疫反应,也能抑制NLRP3炎症小体的激活.在参与免疫调控时,NLRP10以聚集体的形式与接头蛋白ASC结合,继而招募相应免疫信号通路中的其他成员.NLRP10蛋白在结构方面的研究很有限,目前仅有PYD结构域的相关报道.本文在尝试纯化全长人源NLRP10时,同时得到了PYD结构域缺失的稳定蛋白片段,电镜结果表明存在条形和环形两种形态的聚集体.通过序列分析和定点突变,我们找到了潜在的蛋白质降解位点,从而解决了纯化过程中蛋白质降解的问题,为后期的高分辨结构测定奠定了基础.     

TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的构建、表达及生物活性鉴定

目的:构建TANK结合激酶1(TBK1)相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,检测该基因相关突变体在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:根据文献报道的突变序列及QuickChange Site-Directed Mutagenesis实验设计手册,设计合成2条针对TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的引物,以实验室之前构建的TBK1野生型真核表达载体为模板,构建TBK1激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,分别命名为pcDNA3-Flag-TBK1(KD)、pcDNA3-Flag-TBK1(ΔULD)。以LipofactAMINE2000转染试剂转染至293细胞中进行瞬时表达,利用萤光素酶实验检测2种TBK1突变体诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体真核表达载体构建成功,Western印迹检测表明其在293细胞中获得有效表达;用萤光素酶报告基因实验检测,与野生型TBK1相比,其相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体诱导IFN-β转录激活的作用明显降低。结论:真核表达的TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

酵母RNA聚合酶Ⅱ羧基端结构域激酶CTDK-Ⅰ及其亚基的结构与功能

RNA聚合酶Ⅱ最大亚基Rpb1的羧基端结构域(carboxyl-terminal repeat domain,CTD)是RNA聚合酶Ⅱ发挥转录延伸功能所必需的,对其执行精确的转录调节功能至关重要。酵母细胞周期蛋白依赖性激酶CTDK-Ⅰ (carboxyl-terminal repeat domain kinase,CTDK-Ⅰ)由CTK1、CTK2和CTK3组成,作用于RNA聚合酶Ⅱ羧基端结构域,动态磷酸化CTD的七肽重复序列(YSPTSPS)来调控转录和翻译。酵母中的特异性蛋白CTK3与特殊的细胞周期蛋白CTK2结合形成异二聚体,再与CTDK-Ⅰ的催化亚基CTK1结合以调节其活性。CTK1作为细胞周期蛋白CDK (cyclin dependent kinase,CDK)的同源蛋白,其结构与功能的研究可拓展人们对CDK蛋白家族的认识;CTK2-CTK3复合物对CTK1调控机制的研究也可为细胞周期蛋白抑制剂的研发提供新的思路。本文简述了酵母CTDK-Ⅰ的功能特点及其亚基的结构与功能以及亚基间的相互作用,并展望了CTDK-Ⅰ复合物的研究前景。     

PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

目的: 确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法: 将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1^WT, pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156~509), pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156~581), pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果: Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论: PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。     

细胞焦亡机制及与疾病的关系

细胞焦亡(pyroptosis)是近年来发现的一种区别于细胞凋亡的促炎程序性死亡方式。焦亡途径包括半胱天冬酶(caspase)-1介导的经典焦亡途径和Caspase-4/5/11介导的非经典焦亡途径。细胞焦亡涉及多种炎性小体的激活,如核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLR pyrin domain containing 3,NLRP3)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白C4 (NLR containing a caspase recruitment domain 4,NLRC4)以及黑色素瘤缺乏因子2 (absent in melanoma 2,AIM2)等。Gasdermin-D(GSDMD)是参与细胞焦亡的关键切割蛋白,最终导致膜蛋白通道开放、膜孔形成、白细胞介素(interleukins,ILs)释放,从而扩大炎症反应。细胞焦亡介导许多疾病如感染性疾病、神经系统疾病、心血管疾病、代谢性疾病以及炎症免疫性疾病等。本文综述了细胞焦亡机制及与疾病关系的研究进展。     

Krüppel样转录因子8(KLF8)的结构及功能

Krüppel样转录因子8(Krüppel-like factor 8,KLF8)是KLFs家族中的一员.KLF8在羧基端含有3个保守的C2H2锌指结构域,用于与DNA结合.KLF8的转录受粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、KLF1(erythroid krüppel-like fact...     

本期重点推介

<正>维生素B_6在氨基酸代谢中是多种酶的辅酶。磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate,PLP)是维生素B_6的主要辅酶形式,而吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)是PLP的重要生成酶。为明确PLK基因与PLP依赖酶之间转录水平的调节关系,安徽农业大学茶与食品科技学院姚丽丽和黄龙全等采用RNAi方法对家蚕Bombyx mori中PLK基因表达进行干扰,利用实时荧光定量PCR检测家蚕体内磷酸丝氨酸转氨酶(phosphoserine aminotransferase,Ser B)和天门冬氨酸氨基转移酶(asparate aminotransferase,AST)基因的表达量变化情况,结果表明RNA干扰PLK基因后,家蚕后部丝腺中Ser B和AST基因相对表达量明显下调,进一步证明了家蚕PLK基因与