L-鸟氨酸发酵菌种的代谢工程研究进展

L-鸟氨酸是一种非蛋白类氨基酸参与尿素代谢及生物多胺类的合成,其对人体具有治疗肝脏疾病、增强免疫力等作用,被广泛应用于医疗、保健、食品等领域。工业上生产鸟氨酸主要有化学法、酶法及工业发酵法。其中,发酵法因其生产成本及环境保护等方面的优势而逐渐成为研究的焦点。本文归纳了近年来采用基因工程技术选育鸟氨酸高产菌种最新研究进展,重点讨论了产鸟氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造策略,并对未来的研究方向进行了预测。     

L-鸟氨酸高产菌的原生质体融合育种

以谷氨酸高产菌S9114和谷氨酸棒杆菌GS538为出发菌株,应用原生质体融合技术,定向选育出一株L-鸟氨酸高产菌株RH169,该菌株能在发酵液中积累L-鸟氨酸,质量浓度可达19.3 g.L-1。     

微生物发酵法生产L—鸟氨酸

本就微生物生物合成鸟氨酸的途径进行了分析,并提出了以谷氨酸棒杆菌为出发菌株定向选育鸟氨酸高产菌的方法及其发酵工艺条件的优化控制。     

L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究

以代谢控制发酵理论为指导 ,对L -色氨酸产生菌的定向选育、摇瓶发酵条件、30L发酵罐发酵条件进行了研究。以谷氨酸棒杆菌Tx5 - 32 (Phe- +Tyr- )为出发菌株 ,经硫酸二乙酯 (DES)多次诱变处理 ,定向选育出一株L -色氨酸产生菌TQ2 2 2 3(Phe- +Tyr- +5 -MTr+5 -FTr+SGr+CINr)。以摇瓶分批发酵最优条件为基础 ,对菌株TQ2 2 2 3进行了 30L发酵罐分批发酵试验 ,该菌株发酵 6 4h ,产L -色氨酸 7.2 8g·L- 1 。     

钝齿棒杆菌中异源表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶合成L-鸟氨酸的研究

目的:对一株产鸟氨酸的钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5/△proB/△argF(SYPO-1)进行代谢工程改造,筛选不同细菌来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在大肠杆菌中克隆与表达,纯化后对其进行酶学性质的比较;将黏质沙雷氏菌Serratia marcescens Y213来源的Smarg E基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在L-鸟氨酸生产菌株C.crenatum SYPO-1中过量表达,进一步提高L-鸟氨酸的产量。方法:通过利用pDXW10穿梭质粒对不同来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰化酶进行克隆表达和酶学性质比较,选择性质最优来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶编码基因Smarg E在产L-鸟氨酸重组钝齿棒杆菌中表达,考察重组菌株发酵过程中参数的变化。结果:来源于S.marcescens Y213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶比酶活最高为798.98U/mg,最适pH为7,最适温度为37℃,0.1mmol/L的Mg~(2+)、Li~+、Mn~(2+)促进酶的比酶活提高了50%;在钝齿棒杆菌中表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶酶活达到128.4U/ml,显著提高了钝齿棒杆菌中胞内乙酰基循环水平;5L发酵罐发酵重组菌株96h,L-鸟氨酸的产量达到38.5g/L,比出发菌株,L-鸟氨酸的产量提高了33.2%,产率达0.401g/(L·h)。结论:筛选出最佳来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶,在鸟氨酸生产菌株C.crenatum(SYPO-1)中过量表达,可以促进鸟氨酸的前体物质N-乙酰鸟氨酸的快速消耗,实现鸟氨酸的积累。     

L-组氨酸产生菌的选育及其特性的初步研究

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)HZ4221(TRARDCPR AMTRhistidase-)为出发菌株,利用亚硝基胍(NTG)诱变选育得到莽草酸缺陷型的渗漏突变株CLW0560,在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中直接发酵72h,积累L-组氨酸可达5.31g/L。与亲株相比,L-组氨酸产量提高了32.1%,转酮酶比活力下降84.3%。研究了该菌株利用培养基中碳源情况及菌株遗传稳定性,而且考察了金属离子对CLW0560的影响。     

L-精氨酸产生菌诱变育种的研究

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutam icum)ATCC138761为诱变出发菌株,经紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)逐级诱变处理和选育,获得一株能够积累L-精氨酸的菌株UN100-12(SGr,AEr)。在以葡萄糖为碳源、以硫酸铵为氮源的培养基中直接发酵4d,产酸可达16.6 g/L,并具有较好的遗传稳定性。     

钝齿棒杆菌的代谢改造：L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建

【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)的编码基因argG,构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG;考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需,L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L;添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长,但不利于L-瓜氨酸的积累;不添加L-精氨酸时,L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L,同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因,可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累,拓展了该菌株的工业应用范围。     

L-鸟氨酸的化学合成方法

将国内外L-鸟氨酸的化学合成的研究状况作了简要归纳,对主要的三种化学合成路线进行分析介绍。     

产L-丝氨酸菌株SYPS-062的鉴定及碳源对发酵的影响

采用形态学、生理生化实验和16S rDNA序列分析的方法对从自然界中筛选得到的一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸菌株SYPS-062的分类地位进行了研究, 确定其为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。同时考察了碳源对菌株SYPS-062发酵产L-丝氨酸的影响, 实验结果表明, 当蔗糖浓度为60 g/L时, 菌株SYPS-062生物量和L-丝氨酸的积累均达到最大值, 分别为8.1 g/L和6.6 g/L。     

雷帕霉素发酵条件研究

研究了不同发酵条件对雷帕霉素产量的影响。结果显示在最优条件下,进行了100L发酵罐的发酵试验,发酵190-200h雷帕霉素的产量为1200mg／L,产量较优化前提高一倍,达到了工业化生产的要求,为进一步放大生产奠定了基础。     

茁霉多糖发酵及提取工艺条件研究

目的：茁霉多糖是一种新型多功能生物材料,该文拟对出芽短梗霉发酵茁霉多糖及其提取条件进行初步探索。方法：通过摇瓶培养确定了该菌株的发酵优化条件,在此条件下,获得了较高的多糖产量,同时通过醇提的方法对茁霉多糖的提取进也行了研究。结果：初步确定了茁霉多糖最佳发酵与提取条件。结论：摇瓶转速和发酵初始pH值是多糖发酵的重要影响因素,它们与多糖的合成密切相关。     

红酵母RY—981类胡萝卜素发酵助剂的研究

通过探索几种促进剂和前体对红酵母RY－981类胡萝卜素发酵的影响,从中选出了番茄汁和花生油2种对红酵母生长及其类胡萝卜素合成具有显著促进作用的发酵助剂,并确定了适宜的用量。应用试验和发酵过程动态分析表明,这2种发酵助剂增产效果明显（当同时添加番茄汁2.6mL/L和花生油1ml/L时,菌体量、类胡萝卜素含量和产量可分别比对照组提高53．13％、20．29％和84．07％）,且对发酵过程菌体生长及生理代谢规律无不良影响。     

产弹性蛋白酶细菌的发酵动力学研究

基于14L的发酵罐分批发酵实验数据,建立了发酵过程菌体生长、产物生成及基质消耗随时间变化的数学模型。Logistic方程、Luedeking—Piret方程能够很好地分别描述产弹性蛋白酶菌体生长;发酵产酶过程和基质消耗过程。并将3个动力学模型的预测值和实验值进行了比较,所建立的分批发酵动力学模型能较好地反映弹性蛋白酶分批发酵过程。     

混菌发酵对白酒液态发酵效率和风味物质的影响

<正>我国白酒发酵属于典型的自然发酵过程,其特点是在开放的生产环境中,多种不同微生物共同发酵,相互作用,最终形成具有独特风格的白酒。因此,认识微生物群体发酵机制的关键之一是认识微生物之间的相互作用。研究微生物之间的相互作用对于白酒酿造机制的认识,以及酿造技术发展具有重要作用。发酵体系中微生物相互作用关系是白酒功能微生物研究的关键,以往研究多集中于白酒微生物菌群结构及单菌种功能。而选择不同的微生物组合进行发酵,不仅是阐明微生物之间相互作用的常用研究策略,     

苏云金杆菌SD—5菌株发酵生理学研究及生产

通过苏云金杆菌SD－5菌株对混合氨基酸的抗性及在3吨发酵罐中发酵生理学的研究,显示SD－5菌株具有优良的发酵性能。用正交试验设计方法筛选出SD－5菌株发酵培养基配方,菌数可达110－130亿／ml,芽孢率达95％以上。     

提高红酵母胡萝卜素发酵产率的研究

以红酵母RY-998为实验菌株,采用液体摇瓶发酵方式,在培养基中加入氟化铵等6种添加物,研究它们对红酵母和长及胡萝卜素合成的影响。结果表明;除植酸和二甲基亚砜外,氟化铵,醋酸铵,L-亮氨酸和L-缬氨酸对红酵母胡萝卜素产率均有明显的提高作用;当同时添加氟化铵15mg/L,醋酸铵20mg/L,L-亮氨酸40mg/L和L-缬氨酸30mg/L时,细胞生物量,胡萝卜素含量和产率可分别比对照组提高42.2%,55.4%和121.2%。     

Stillage backset and its impact on ethanol fermentation by the flocculating yeast

The second largest cost in fuel ethanol production is from energy consumption with ethanol distillation and stillage treatment, particularly when stillage is treated by the multi-evaporation process. Therefore, stillage backset is the most economically competitive strategy for reducing discharge and saving energy consumption. In this article, continuous ethanol fermentation was performed by the flocculating yeast under stillage backset conditions. Compared to regular yeast, immobilized yeast within the fermentor through flocculation reduced byproducts formation in the stillage, since heat lysis of yeast during ethanol distillation was prevented, and many side reactions were thus eliminated, making more stillage backset within the fermentation system possible. Although pyruvic acid, succinic acid, citric acid, α-ketoglutaric acid, fumaric acid and glycerol from yeast metabolism, furfural and 5-hydroxymethyl furfural from process operations, and acetic acid and lactic acid from slight contamination were accumulated with the stillage backset, they had no significant impact on yeast growth and ethanol fermentation due to low concentrations accumulated within the fermentation system. However, propionic acid that was generated mainly during hydrolysate sterilization and distillation of the fermentation broth was detected as the major inhibitor, but this byproduct would be significantly reduced under industrial conditions without hydrolysate sterilization, making the stillage backset more reliable for industrial application.     

田间施药对自然发酵葡萄酒酵母菌群落结构的影响

【背景】酵母菌是葡萄酒发酵过程中一类非常重要的微生物,其多样性及群体组成对葡萄酒的质量有重要贡献。影响葡萄酒中酵母菌组成的因素有很多,但目前尚未见葡萄园田管理对葡萄酒酵母菌群落结构影响方面的报道。【目的】探索田间施药对自然发酵葡萄酒酵母菌群落结构的影响。【方法】采用分离培养、常规分子生物学鉴定和Illumina MiSeq宏基因组测序结合的方法分析不同样品中的酵母菌群落结构情况。【结果】从不使用内吸收型化学农药的葡萄样品自然发酵液中分离鉴定出Pichia、Hanseniaspora、Schizosaccharomyces、Candida、Saccharomyces、Zygoascus、Issatchenkia等7个属8个种的酵母菌,宏基因组测序结果表明有Pichia(29.42%)、Saccharomyces(21.91%)、Issatchenkia(17.99%)、 Hanseniaspora(12.10%)、 Candida(7.47%)、 Zygosaccharomyces(5.32%)、Schizosaccharomyces (3.07%)、Aureobasidium (0.29%)等属的酵母菌参与发酵;使用常规化学农药的葡萄样品自然发酵液中分离鉴定出Pichia、Hanseniaspora、Schizosaccharomyces、Candida、Cryptococcus等5个属6个种的酵母菌,宏基因组测序结果表明有Pichia (41.66%)、Hanseniaspora (21.54%)、Candida(19.11%)、 Zygosaccharomyces(7.78%)、 Schizosaccharomyces(4.04%)、 Cryptococcus(3.21%)、Saccharomyces (1.12%)、Aureobasidium (0.49%)等属的酵母菌参与发酵。【结论】两样品中酵母菌比例有显著差异,表明在酿酒葡萄的园田管理中化学农药的使用对自然发酵葡萄酒的酵母菌群落结构有较大影响。