人热休克因子1对抗增殖蛋白基因启动子转录调控的研究

目的：研究人热休克因子1（hHSF1）对抗增殖蛋白（pmhibitin）动子转录活性的影响。方法：采用PCR方法扩增hHSF1全长编码序列,构建peDNA3．1（＋）-hHSFl真核表达载体,将peDNA3．1（＋）-hHSF1和人prohibitin基因启动子表达载体pGL3-prohibitin共同转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测双荧光索酶活性,分析hHSF1对抗增殖蛋白基因启动子的转录调控作用。结果：成功构建peDNA3．1（＋）-hHSF1真核表达载体,荧光素酶活性测定发现hHSF1明显上调pGL3-prohibitin转录。结论：hHSF1对prohibitin具有转录调控作用。     

WT1基因在转录调控中的作用

ＷＴ１基因于１９９０年发现,在某些组织中特异表达,它的蛋白质产物在转录调控中起一种双向转录因子作用。它自身表达也受很多因素的调控。西方综述了近年来国内外关于ＷＴ１基因在转录调失方面的作用的研究进展。     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

人类高度进化保守基因hnulp1中转录抑制区段的定位

hnulp1是具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)的新的一类转录因子.其C端含一个DUF654结构域,其序列在同源基因中相当保守,但该结构域功能未知.利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域(DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4-Luc)质粒,构建了哺乳动物细胞转录因子活性分析系统,随后利用GAL4-Luc荧光素酶报告基因对5种含DUF654结构域的不同缺失片段转录抑制活性进行检测.检测结果表明,该基因DUF654结构域中从Δ228-407氨基酸区段具有强烈的转录抑制活性.该结果为进一步研究DUF654结构域的功能和hnulp1基因转录调控的机制奠定了基础.     

PKC对人mdr1基因转录调控的研究

研究了ＰＫＣα、β１和β２亚型对多药耐药基因ｍｄｒ１转录的调控作用．以ｍｄｒ１基因上游调控序列驱动的虫荧光素酶报告基因表达载体和ＰＫＣ基因表达载体共同转染ＣＯＳ７细胞后,测定虫荧光素酶报告基因表达水平．实验结果表明,ＰＫＣα、β１及β２对ｍｄｒ１基因的转录有下调作用,ＰＭＡ可进一步加强这一作用;在此转染体系中,ＰＫＣ抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ也可抑制ｍｄｒ１基因的转录,但在只转染ｍｄｒｌｕｃ的细胞中,ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ对ｍｄｒ１的转录则没有影响,提示ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ仅在ＰＫＣ过量表达的细胞中抑制ｍｄｒ１基因的转录．     

胰岛素基因的转录调控

胰岛素基因的转录是一个十分复杂的网络式调控过程,主要通过该基因上游调控序列的启动子、增强子与转录因子复合物的相互作用来实现;多种证据表明胰岛因子1可能参与其中,对其具体机制的研究将是该领域的研究方向之一。     

大肠杆菌yigP基因转录调控序列的鉴定

【目的】调查yigP基因启动子的活性,并对该转录调控序列进行分析。【方法】以lacZ为报告基因,克隆启动子片段至启动子探针质粒中,通过检测β-半乳糖苷酶活性判断启动子活性,并通过克隆一系列逐步缩短的启动子片段来确定启动子所在区域。利用定点突变技术,对启动子的重要序列进行定点突变,调查其对启动子活性的影响。【结果】确定了yigP基因启动子的区域,鉴定了启动子的-10区和-35区,并发现了启动子上游存在一个负调控序列,对该序列进行了初步的研究显示其中部分序列是这种负调控作用的核心序列。【结论】对yigP基因的转录调控序列进行了鉴定,丰富了我们对基因转录调控的认识。     

开发缺氧调控载体用于肾性贫血的基因治疗

目的:开发具有缺氧调控活性的基因治疗载体,其表达可由缺氧选择性诱导,用于肾性贫血的逆转和治疗。方法:合成源于各种缺氧应答基因的缺氧应答元件(HRE)寡核苷酸序列,与CMV启动子连接组合,测定荧光素酶的相对活性以确定缺氧转录活性。结果:在各种缺氧调控载体中,由鼠PGK(mPGK)基因的HRE序列和CMV启动子组合成的缺氧应答启动子显示出14.6倍的高缺氧应答性,而且缺氧诱导的表达水平与完整的CMVI.E启动子在常氧环境下的转录水平相近。结论:3HRE/mPGK/CMV缺氧调控载体对于肾性贫血等一系列疾病实现目的基因的精确调控表达可能非常有用。     

人SATB1基因5′上游序列的转录激活功能分析

在对人SATB1基因进行生物信息学分析的基础上 ,采用PCR技术 ,扩增人基因组DNA中SATB1基因 5′上游序列的 - 2 95 5～ - 9片段 ,构建了 3个分别由SATB1基因 5′上游 - 2 95 5～ - 9,- 172 7～ - 9和 - 76 0～ - 9序列片段驱动的报告载体 -pGL3 SP2 94 6 luc ,pGL3 SP1718 luc和pGL3 SP75 1 luc ,分别瞬时转染JurkatT ,K5 6 2 ,U937和HeLa细胞 ,通过测定荧光素酶的表达活性 ,观察SATB1基因 5′上游序列片段 3个删除突变体在不同细胞内活性的差异 .结果显示 ,SATB1上游序列- 2 95 5 - 9在 4种细胞中的转录激活能力为U937>JurkatT >K5 6 2 ,在HeLa细胞中基本无激活 ,提示SATB1的转录激活可能具有一定的细胞类型特异性 .3种 5′删除突变体转录激活性由大至小顺序为 - 76 0 - 9>- 2 95 5 - 9>- 172 7 - 9,提示SATB1的核心启动子可能存在于其 5′上游序列的- 76 0至 - 9bp区域中 .     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚．为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58)．其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性．最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1 (由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体) 分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达．研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要．     

HIV-1基因表达的转录调控

高效抗逆转录病毒治疗（HAART）可以有效地抑制人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）的复制及血浆病毒载量,延缓发病进程,改善、提高患者的生活质量和存活时间。但是,一旦停止治疗就会导致血浆病毒血症迅速反弹,HIV-1以原病毒的形式在静息记忆CD4⁺T等细胞中的持续存在是清除HIV-1的一个障碍。HIV-1基因转录的激活与阻抑决定了受感染细胞进入产毒性感染或潜伏感染。本文从原病毒整合位置与转录干扰、细胞转录因子与HIV-1启动子相互作用招募RNA聚合酶起始转录、转录的表观遗传调控和反式激活因子Tat及其相关蛋白促进转录延伸等方面探讨了HIV-1原病毒转录调控机制。     

Myocardin调控心肌H9C2细胞Ca2+通道机制研究

目的：研究同样在维持心脏正常结构和功能过程中发挥着重要作用的转录因子心肌素Myocardin对L型Ca²⁺通道Cav1.2的转录调控作用及分子机制。方法：全细胞膜片钳技术记录心肌细胞膜Ca²⁺电流,慢病毒包装技术制备Myocardin-GFP慢病毒用于感染心肌细胞以过表达Myocardin,Real-time PCR定量检测Cav1.2基因mRNA水平,Western blotting检测Cav1.2蛋白表达水平。PCR介导的定点突变技术得到Ca²⁺通道启动子区特定CarGbox位点突变的突变体。荧光素酶报告系统检测野生型WT和突变体MU启动子活性,以确定Myocardin在Cav1.2基因启动子区的作用位点。结果：全细胞膜片钳技术表明Myocardin激活Cav1.2而增加心肌细胞膜Ca²⁺电流,real-time PCR和Western blotting结果表明,Myocardin激活Cav1.2基因的转录和表达,荧光素酶报告系统检测突变体启动子活性,发现Myocardin激活Cav1.2基因的转录依赖其启动子区的CarGbox。结论：Myocardin通过与Cav1.2基因启动子区CarGbox结合进而激活其转录和表达,促进Ca²⁺通道蛋白装配到心肌细胞膜上,加强Ca²⁺内流,增强膜电流。     

Hey1基因参与调控BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化

目的:观察发状分裂相关增强子Hey1在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:包装Hey1、BMP9以及GFP的过表达慢病毒,并分别作用于C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒是否包装成功,碱性磷酸酶(ALP)检测早期成骨指标ALP的变化,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,MTT检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞增值的影响,流式细胞术检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期的影响。结果:Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒包装成功;在成骨分化早期,过表达Hey1基因可促进BMP9调控的C3H10T1/2细胞的成骨分化与增殖;在成骨分化晚期,过表达Hey1基因可促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化,并将BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期阻滞在G1期。结论:Hey1基因可参与调控BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2细胞的早晚期成骨分化,并对细胞的增殖与周期有一定的影响。     

Potential Role for PAD2 in Gene Regulation in Breast Cancer Cells

The peptidylarginine deiminase (PAD) family of enzymes post-translationally convert positively charged arginine residues in substrate proteins to the neutral, non-standard residue citrulline. PAD family members 1, 2, 3, and 6 have previously been localized to the cell cytoplasm and, thus, their potential to regulate gene activity has not been described. We recently demonstrated that PAD2 is expressed in the canine mammary gland epithelium and that levels of histone citrullination in this tissue correlate with PAD2 expression. Given these observations, we decided to test whether PAD2 might localize to the nuclear compartment of the human mammary epithelium and regulate gene activity in these cells. Here we show, for the first time, that PAD2 is specifically expressed in human mammary gland epithelial cells and that a portion of PAD2 associates with chromatin in MCF-7 breast cancer cells. We investigated a potential nuclear function for PAD2 by microarray, qPCR, and chromatin immunoprecipitation analysis. Results show that the expression of a unique subset of genes is disregulated following depletion of PAD2 from MCF-7 cells. Further, ChIP analysis of two of the most highly up- and down-regulated genes (PTN and MAGEA12, respectively) found that PAD2 binds directly to these gene promoters and that the likely mechanism by which PAD2 regulates expression of these genes is via citrullination of arginine residues 2-8-17 on histone H3 tails. Thus, our findings define a novel role for PAD2 in gene expression in human mammary epithelial cells.     

TAK1siRNA对C2C12细胞内TAK1基因表达的影响

目的:高效下调TAK1基因表达的小干扰RNA(siRNA)分子的获得.方法:采用脂质体转染方法,将3对(siRNA ID#94455、siRNA ID # 94549、siRNA ID # 189006)人工合成的TAK1基因特异的小干扰RNA(siRNA)分子分别导入小鼠成肌细胞C2C12中,采用实时荧光定量PCR方法分析细胞内TAK1基因的相对表达.结果:和对照组相比,siRNA ID # 94455、siRNA ID # 94549和siRNA ID # 189006分别下调了细胞内TAK1基因的mRNA表达水平33.34%、46.73%和79.97%.结论:实验获得了能够高效下调TAK1基因表达的siRNA.