精胺对牛肝tRNA^lle氨基酰化的刺激作用

本实验用纯化的牛肝异亮氨酸ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ）和异亮氨酰ｔＲＮＡ合成酶,研究了精胺对Ｉｌｅ－ｔＲＮＡ复合物形成及ＩｌｅＲＳ活性的作用。结果表明：精胺能特异地促使牛肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ氨基酰化反应;对ＩｌｅＲＳ活性无影响;能明显地增加形成Ｉｌｅ－ｔＲＮＡ复合物反应的Ｖｍａｘ和ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ的Ｋｍ值。     

线粒体tRNA^Trp的原核起源

构建了３种来源于水稻、人和啤酒酵母的线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ基因。实验表明这些线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的体外转录产物具有被枯草杆菌色氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＴｒｐＲＳ）氨酰化的能力,但是不能被鼠肝来源的氨酰ｔＲＮＡ合成酶粗酶所催化。动力学资源常数测定表明枯草杆菌ＴｒｐＲＳ对线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的亲和力为野生型ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的一半,而在催化效率上,水稻和啤酒酵母线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的色氨酰化能力比野     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡ＾Ａｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／     

精胺和Mg~（2＋）对tRNA~（Ile）圆二向色谱的影响

由于精胺（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）能特异地刺激哺乳动物ｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）的氨基酰化,本文用纯化的牛肝ｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）观察了精胺和Ｍｇ（２＋）对ｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）ＣＤ光谱的影响。结果显示：Ｍｇ（２＋）可使牛肝ｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）ＣＤ光谱峰向短波方向偏移２ｎｍ,波峰为２６３ｎｍ,峰值被增大约１０％,ΔθＭｇ（２＋）＝２．３×１０３ｄｅｇ·ｃｍ２／ｄｍｏｌ;而精胺使牛肝ｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）ＣＤ光谱峰减少４０％,Δθｓｐｅｒｍｉｎｅ＝１×１０（－４）ｄｅｇ·ｃｍ２／ｄｍｏｌ;精胺和Ｍｇ（２＋）对肝ｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）－ＩｌｅＲＳ复合物或ＩｌｅＲＳ的ＣＤ光谱基本无影响。表明Ｍｇ（２＋）和精胺可影响牛肝ｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）的构象。实验同时以酵母ｔＲＮＡ（Ｐｈｅ）和Ｅ·ｃｏｌｉｔＲＮＡ~（Ｉｌｅ）作为对照。     

大肠杆菌tRNA~(Leu)的提取、纯化及性质研究

采用高表达大肠杆菌ｔＲＮＡＬｅｕ菌株提取、纯化了亮氨酸等受体转移核糖核酸ｔＲＮＡＬｅｕ１和ｔＲＮＡＬｅｕ２．利用稳态动力学手段研究了ｔＲＮＡＬｅｕ１及脱镁ｔＲＮＡＬｅｕ１在不同稀土离子作用下与纯化亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶的氨酰化作用．ｔＲＮＡＬｅｕ１与亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶的结合及催化效率均受参与稀土离子的影响,表观Ｋｍ值有较明显的变化．结果表明,亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶催化的ｔＲＮＡＬｅｕ１氨酰化反应所需Ｍｇ２＋能够被稀土离子取代,但亲合性能不同．     

编码大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的基因（argS）拥？…

编码大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因（ａｒｇＳ）和编码亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）的基因（ＬｅｕＳ）分别插入ｐＵＣ１８后,各自在Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中的表达有很大的差异（高表达倍数分别为１０００和３５倍）。为了调查造成其表达差异的原因,用ａｒｇＳ的５＇上游非编码区取代ｌｅｕＳ的５＇上游非编码区,构建了融合基因ｐａｒｇ－ｌｅｕＳ;将它插入质粒ｐＵＣ１８     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡＡｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和１．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１６０００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为１６ｓ－１;ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力对精氨酸、ＡＴＰ和ＰＰｉ的Ｋｍ分别为９２．９μｍｏｌ／Ｌ、０．８５ｍｍｏｌ／Ｌ和８０．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为２８０００～３００００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为３２ｓ－１．ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的荧光激发光谱和发射光谱与ＡｒｇＲＳ基本相同。热失活速度比天然酶慢。     

不同生境芦苇tRNA的分离纯化及氨酰化特性研究

用苯酚法,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ＿（２５）柱层析分离并纯化了河西走廊分布的不同生境芦苇的ｔＲＮＡ。用ｔＲ－ＮＡ结合￣３Ｈ－Ｌｅｕ、￣３Ｈ－Ｇｌｙ及￣３Ｈ－Ａｌａ的氨酰化活性研究了四种生境芦苇的ｔＲＮＡ氨酰化特性。结果表明,三种￣３Ｈ－氨基酸的ｔＲＮＡ氨酰化活性在不同生境之间及同一生境芦苇的不同发育时期表现出极大差别;ｔＲＮＡ含量也存在类似的变化,表现在沙生芦苇与沼泽芦苇５－９月份含量均增高,盐化草甸－沙丘过渡带芦苇中ｔＲＮＡ含量均较其它生境芦苇低,而盐化草甸芦苇中以７月份含量最高;蛋白水解酶活性除沙生芦苇９月份降低外,其余三种生境芦苇均呈增高趋势;蛋白质含量在盐化草甸芦苇中与总氨酰化活性变化相一致,而过渡带芦苇与蛋白水解酶活性变化类似,沙生芦苇５月份表现为水解占优势后期则主要与合成有关,沼泽芦苇７、９月份却与水解相关。产生这些结果的原因之一是芦苇代谢对各自生境适应的差异性。     

大鼠肝tRNA^Ile基因在大肠杆菌中的表达及分离纯化

利用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶／启动子表达系统在大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中表达化学合成的大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ基因,经酚抽提,ＤＥＡＥ－５２离子交换柱层极及ＰＬＣ层析,分离纯化大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｎｏｐｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定表明,大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ基因成功地获得表达,氨酰化活性检测表明,纯化后,每１Ａ２６０（４０μｇ）的ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ可负载约６５０ｐｍｏｌ的Ｉｌｅ     

大肠杆菌JM83精氨酰－tRNA合成酶基因的克隆、测序及表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以大肠杆菌ＪＭ８３基因组ＤＮＡ为模板,扩增了精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）基因。将该基因重组到载体ｐＵＣ１８上转化到大肠杆菌ＴＧ１中,得到在转化子中ＡｒｇＲＳ的高表达。粗抽液中ＡｒｇＲＳ的氨酰化活力,ＴＧ１和ＴＧ１转化子分别为１．６５Ｕ／ｍｇ和２１０Ｕ／ｍｇ,后者为前者的１２７倍。ＤＮＡ顺序测定表明,与从大肠杆菌ＪＡ２００中克隆到的ＡｒｇＲＳ基因相比９１３位碱基为Ａ而不为Ｃ,这种变化使ＡｒｇＲＳ的３０５位氨基酸残基由Ｇｌｎ变为Ｌｙｓ,但这种改变不影响酶的活力。