产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达

为了实现GL-7-ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达,将GL-7-ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列,并将其连接到质粒pET-28a,通过筛选得到了表达GL-7-ACA酰化酶的重组菌B121(DE3),pET-ACY。分别考察了诱导温度、菌浓(OD600)、诱导剂IFrG的用量等因素对重组菌表达GL-7-ACA酰化酶的影响。在优化条件下,GL-7-ACA酰化酶酶活可达266U／L。GL-7-ACA酰化酶经一步DEAE-Sepharose纯化即可达到80％的纯度,酶活收率为50％。     

产GL-7-ACA酰化酶重组菌的构建及高表达研究

戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰化酶是7-氨基头孢烷酸(7-ACA)两步酶法生产中的关键酶。成功构建组成型表达的产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌JM105/pMKC-ACY,并对其高表达条件进行了研究,得到了组成简单、廉价的国产培养基配方及操作简便、易于实现工业化的发酵工艺。在优化条件下,上罐补料高密度发酵的酶活高达6668.9U/L,是优化前的12.4倍,产率最高可达275.5U/(L.h),达到了工业生产的要求。     

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg^(-1)。Ca^(2+)、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mg^(2+)等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L^(-1)和9.88mmol·L^(-1)。     

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg~(-1)。Ca²⁺、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu²⁺、Fe²⁺和Mg²⁺等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L~(-1)和9.88mmol·L~(-1)。     

GL-7-ACA酰化酶发酵培养基的均匀优化设计

采用国产原料,应用均匀设计优选试验方法,对GL-7-ACA酰化酶生产用的发酵培养基配方进行了优化,取得了良好的效果,最终摇瓶效价达3919．03U／L。     

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7ACA)酰化酶能够催化GL-7ACA分解生成 7-ACA ,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL-7ACA酰化酶及其突变体的表达 ,本研究通过构建一系列质粒载体 ,建立了两个简便有效地测定GL-7ACA酰化酶基因acy表达量的系统 ,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因 ,即儿茶酚双加氧酶基因 (xylE)和 β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)分别置于acy基因的下游 ,使之与acy基因共用一个启动子 ,进行串联表达 ,各自构成一个多顺反子系统。实验证明 ,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或 β-半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。     

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰－7－氨基头孢烷酸（GL－7ACA）酰化酶能够催化GL－7ACA分解生成7－ACA,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL－7ACA酰化酶及其突变体的表达,本研究通过构建一系列质粒载体,建立了两个简便有效地测定GL－7ACA酰化酶基因acy表达量的系统,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因,即儿茶酚双加氧酶基因（xylE)和β－半乳糖苷酶基因（lacZ)分别置于acy基因的下游,使之与acy基因共用一个启动子,进行串联表达,各自构成一个多顺反子系统。实验证明,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或β－半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。     

GL—7—ACA酰化酶在大肠杆菌中的分泌表达

利用来自假单胞菌的ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了ＧＬ－０７－ＡＣＡ酰化酶的分泌型高表达质粒ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ,其中ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ为ＩＰＴＧ诱导型质粒,ｐＫＫＣＡ１Ｓ为组成型质粒。ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ转入受体菌ＴＧ１中都可高表达ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为２３．９单位每克菌体和１８．３单位每克菌体     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7-ACA)酰化酶 (3.1.5.11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR204pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7.5～ 8.5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g/L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g/L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4.0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

米曲氨基酰化酶菌株的选育*

利用原生质体融合技术对米曲霉3042和米曲霉10B,进行了营养互补融合。以30%PEG(MW=6000)、0.01mol/L CaCl₂、0.05mol/L Gly做为融合剂,融合频率达到0.47%。共获得26株绿色融合株,并对其杂合二倍体的孢子进行了PFA和UV的诱发分离,获得一株生长速度快、氨基酰化酶活性高的单倍体菌株。     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰化酶(3．1．5．11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解,形成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上,进一步对酰化酶基因工程菌Escherichia coli MMR204／pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明,工程菌的最佳发酵温度为33℃,pH7．5～8．5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖(1～5g／L),可提高发酵生物量和产酶水平,但葡萄糖的过量补加(6g／L以上),则导致发酵液偏酸(低至pH4．0)而完全抑制酰化酶生成,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现,三种方式的补糖条件下,acy基因在tac启动子控制下,呈组成型表达,细胞生长与产酶同步,无需诱导;其中,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

头孢菌素酰化酶基因在大肠杆菌中的表达规律

假单孢菌sp .130头孢菌素酰化酶催化戊二酰 7 氨基头孢烷酸的水解反应 ,生成 7 氨基头孢烷酸。 7 氨基头孢烷酸是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。在 6种大肠杆菌表达质粒上构建了表达该酶的不同载体 ,得到了不同表达结果的大肠杆菌转化子。这些质粒有各自的特点 ,适用于不同的场合。     

假单胞菌sp.130 GL-7-ACA酰化酶的核苷酸和蛋白质序列分析

对来源于假单胞菌sp.130的戊二酰-7-氨基头孢烷酸（GL－7－ACA）酰化酶结构基因的全序列及所编码蛋白质的α,β亚基的N末端和C末端的氨基酸序列进行了测定。将蛋白质序列与其他同类的GL－7－ACA酰化酶进行了同源性比较,结果显示该酶与来源于假单胞菌GK16和C427的酰化酶的序列有较高同源性,而与其它同类酰化酶的同源性较低。这些酶的α亚基N－末端差别较大,但是β－亚基的N－末端有较高的保守性。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的高效表达*

利用基因改造的方法可以优化外源基因在大肠杆菌中的表达。利用逆转录PCR技术从原代培养的人成纤维细胞中克隆出人碱性成纤维细胞生长因子基因,在不改变氨基酸序列的前提下对该基因的上游部分序列进行改造,并将其插入表达载体pET-3c,转入大肠杆菌阳BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达蛋白占菌体总蛋白的30％以上,并具有良好的生物活性。     

产纤维素酶大肠杆菌工程菌的构建和酶的表达

为了使大肠杆菌(Escherichia coli)具备生产纤维素酶的能力,从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PKC-001克隆碱性纤维素酶基因,进行密码子优化后连到载体pET-22b,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,对工程菌进行表达优化并分析纤维素酶酶活。结果表明大肠杆菌工程菌能生产分子量约39 kD的纤维素酶,在培养温度20℃、摇床转速170 r/min、IPTG终浓度0.01 mmol/L的条件下,纤维素酶的产量最大;在酸性条件下,细胞内和细胞外的滤纸酶活力(FPA)分别为5.78 U/mL和1.13 U/mL,在碱性条件下检测不到滤纸酶活。显然,重组纤维素酶仅在酸性条件下有活力。     

雷氏普罗威登斯菌青霉素G酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

利用PCR和分子克隆技术从雷氏普罗威登斯菌（Prouidencia rettgeri)(ATCC29944)的基因组DNA中获得一个青霉素G酰化酶（penicillinGacylase,PGA)基因并将其装入表达质粒pET24a。携带有重组质粒pETPGA的Escherichia coli基因工程菌BL21（DE3）/pETPGA实现了PGA的高效表达,对发酵条件的研究表明基因工程菌在24℃,添加5g/L甘油条件下以1.0mmol/LIPTG诱导1.5h酶活力即达到993.4U/L,比野生菌酶活力（15U/L）提高了66倍。     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

GL－7－ACA酰化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

本文报道了利用BamHⅠ酶解的载体pBR322 DNA与Sau3A部分酶解的假单胞菌Ps．130染色体DNA片段构建重组质粒,并用³²P标记的寡核苷酸探针从3205个含有外源片段的重组质粒中检测得到7株阳性克隆株。进一步经¹²⁵Ⅰ标记的抗体／抗原放射免疫反应、GL－7－ACA酰化酶活力测定以及酶反应产物的纸谱色层分析,由上述7株阳性株中鉴定出3株能在大肠杆菌中表达酰化酶活力的基因克隆株。对该3株菌的重组质粒——pMR 5、pMR 6和pMR-7-DNA的初步凝胶电泳分析表明,pMR 5和pMR 7质粒中插入片段的分子量为6．8kb,质粒pMR 6则带有5．7kb的外源片段。实验还比较了重组质粒pMR 5在8株不同的大肠杆菌宿主菌中,GL－7－ACA酰化酶的表达水平。