齿肋赤藓热激蛋白60基因的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得耐旱苔藓齿肋赤藓的热激蛋白60基因,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、结构保守域、理化性质、信号肽、疏水性／亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域、二级结构、功能域、活性位点、及同源性等方面进行了预测和分析。结果表明：齿肋赤藓热激蛋白60基因全长1841bp,开放阅读框1581bp,编码526个氨基酸残基;编码蛋白含有GroEL保守域,是chaperon-like superfamily家族;亚细胞定位分析显示,编码蛋白位于内质网中;活性化位点分析表明,编码蛋白存在6类活性位点;同源性分析表明,齿肋赤藓热激蛋白60与小立碗藓预测的HSP60同源性最高,达到92％,与卷柏的HSP60次之,同源性达88．83％。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

马铃薯HSP17.7基因的克隆及其对高温逆境的响应

热激蛋白和植物对高温的响应密切相关,同时在植物生长发育调控和逆境抵抗等方面具有重要作用。该研究克隆了马铃薯热激蛋白基因StHSP17.7(GenBank登录号为XP_006350804.1),对其全长cDNA序列进行了相关生物信息学分析,并利用qRT-PCR分析StHSP17.7基因在高温胁迫下的差异表达特性。结果显示:(1)StHSP17.7全长755bp,包含465bp开放阅读框,编码154个氨基酸。(2)StHSP17.7分子质量约为17.62kD,等电点7.91,为亲水性蛋白,C端含有保守序列Ⅰ和Ⅱ组成的ACD结构域,属于典型的sHSPs家族成员。(3)系统进化分析发现马铃薯小分子热激蛋白归为12个亚家族,其中StHSP17.7与马铃薯HSP17.6蛋白亲缘关系较近,属于小分子热激蛋白C的Ⅰ类家族成员;基因结构分析显示,在马铃薯48个sHSP基因中,StHSP17.7基因不含内含子,含1个内含子的基因有23个,占47.9%。(4)qRT-PCR分析显示,高温能够快速诱导StHSP17.7基因表达,且基因表达量呈爆发式变化,在24h达到最高值。研究表明,StHSP17.7基因明显参与了马铃薯对高温的响应。     

橡胶树胶乳高表达热激蛋白HbHSP90.4基因抗逆功能分析

为了分析热激蛋白90（HSP90）基因在橡胶树（Hevea brasiliensis）逆境胁迫和激素转导中的作用,利用PCR技术从橡胶树品种热研73397胶乳中克隆得到HbHSP90.4基因全长cDNA序列,该基因含有1个2 451 bp开放阅读框（ORF）,编码816个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbHSP90.4含有HSP90 superfamily和HATPase superfamily结构域,属于HSP90家族成员。系统进化分析发现该蛋白与木薯MeHSP90具有较近的亲缘关系。亚细胞定位预测显示HbHSP90.4基因定位在内质网。qRT-PCR结果表明HbHSP90.4基因主要在橡胶树胶乳中表达。干旱、冷胁迫、橡胶树白粉菌侵染、H₂O₂和MeJA处理均可促进胶乳HbHSP90.4基因上调表达,而其在ETH、SA和ABA处理中均呈现显著下调表达。构建植物表达载体HbHSP90.4-mScarlet,为进一步的转基因植物的做成准备了材料。本研究为阐明胶乳HbHSP90.4基因响应橡胶树逆境胁迫过程和植物激素信号传导途径分子调控机制奠定坚实基础。     

木薯SYP基因的序列特征及表达分析

植物突触融合蛋白(SYP)是一类与植物细胞内囊泡介导转运有关的蛋白。部分SYP基因与植物对生物和非生物胁迫的响应有关。该文利用生物信息学工具分析了木薯(Manihot esculenta)SYP基因及其蛋白结构、核苷酸多态性和系统进化关系, 并利用RT-PCR技术检测了木薯不同组织中SYP基因的表达。结果表明, 木薯SYP基因及其蛋白结构均具有明显的规律性和家族成员间的保守性; SYP基因的cDNA在基因间以及不同品种间具高度一致性, 核苷酸变异以同义替换为主。进化分析表明, 植物SYP基因可分为2个亚家族, 木薯SYP基因倾向于与蓖麻(Ricinus communis)SYP基因聚在进化树同一分支的末端。半定量RT-PCR分析表明, 5个木薯SYP家族成员具有组织特异性。上述研究结果为木薯SYP基因功能研究和功能单核苷酸标记的开发奠定了重要基础。     

木薯Actin基因片段的克隆及序列分析

克隆木薯Actin基因片段,为研究其他基因在木薯中的表达和调控提供内参基因.通过比较拟南芥、蓖麻和麻风树Actin基因cDNA同源区域,根据基因的保守序列设计一对简并性引物,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段,使用分子生物学软件进行分析.结果显示,获得一段大小为698 bp的基因片段,编码233个氨基酸;该基因序列与其他Actin基因核苷酸序列的同源性均在85%以上,氨基酸序列的同源性达94%以上;系统进化分析表明,木薯Actin基因与大戟科植物橡胶、麻风树及蓖麻的亲缘关系最近,与毛果杨、陆地棉及木瓜等植物Actin基因具有较高的保守性.克隆的基因片段为木薯Actin基因片段,并命名为msACT.     

甜菜夜蛾HSP90基因克隆及高温胁迫下其表达量的变化

为阐明热激蛋白90（heat shock protein 90, HSP90）在甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)幼虫抵抗高温过程中的作用, 克隆了其HSP90基因cDNA全长序列, 并检测了在系列高温胁迫下不同龄期幼虫体内其相对表达量。根据已报道的热激蛋白90基因序列同源性设计简并引物, 利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术成功克隆了甜菜夜蛾HSP90基因全长cDNA（GenBank登录号FJ862050）。该cDNA序列开放阅读框长2 154 bp, 编码717个氨基酸, 预测的相对分子量和等电点分别为82.6 kD和5.0。该序列具有HSP90家族的典型特征和特殊的功能结构域, 并且与多种生物的HSP90基因序列有较高的同源性。为了研究HSP90抵抗高温的作用, 构建荧光定量RT-PCR体系, 检测了37, 39, 41, 43和45℃胁迫下甜菜夜蛾不同龄期幼虫体内HSP90表达量的变化。结果表明, 高温胁迫对甜菜夜蛾幼虫体内的HSP90表达具有明显的诱导作用。幼虫体内HSP90表达量随着温度升高呈增加的趋势。43℃和45℃胁迫下, 各龄幼虫体内HSP90的表达量均显著高于常温（P< 0.05）, 但不同龄期之间没有显著差异。这说明HSP90在甜菜夜蛾幼虫抗高温中起到重要作用。     

水稻锌指蛋白基因OsBBX6的克隆、表达及生物信息学分析

锌指蛋白作为植物体内一类重要的转录因子,对植物生长发育、基因调控以及响应外界环境变化方面发挥重要作用。Os BBX6基因属于水稻锌指蛋白B-Box基因家族成员,启动子元件分析发现其含有高温应答元件(HSE)、干旱应答元件(MBS)及非生物胁迫响应元件(TC-rich repeats)等逆境相关元件。组织特异性定量表达分析表明,Os BBX6在叶片中表达最高,根其次,茎和幼穗中表达最低。胁迫处理后的荧光定量PCR发现其受低温诱导上调,受高温、干旱、盐胁迫等抑制表达,表明其正向响应低温胁迫,负向响应高温、干旱、盐胁迫等。另外,本研究还克隆了OsBBX6基因,并对其进行了系统进化、蛋白跨膜、蛋白亚细胞定位及OsBBX6基因共表达等分析,为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

花楸树HSP70基因家族鉴定及其应答非生物胁迫表达分析

热激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)在植物生长发育和非生物胁迫响应过程中发挥着重要作用。研究HSP70基因家族,能够弥补花楸树(Sorbus pohuashanensis)抗性相关基因研究的不足。本研究利用生物信息学方法对花楸树基因组中的HSP70基因家族进行了鉴定,并对其基因结构、系统发育关系、染色体定位和非生物胁迫下的表达进行了分析。分析结果表明,花楸树基因组中共包含22个HSP70基因家族成员,它们不均匀地分布在13条染色体上,根据系统发育关系将其分为5组,较多分组中的基因都具有相似的基因结构和保守基序。从22个HSP70基因中鉴定到两对串联重复基因和涉及13个基因的13个片段重复事件,且每一对基因的Ka/Ks值都小于1,说明花楸树HSP70基因家族在进化过程中受到了纯化作用。花楸树HSP70基因的启动子区域中存在多种与非生物胁迫相关的顺式作用元件,且随机挑选的6个HSP70基因对高温、NaCl盐以及干旱胁迫都具有不同程度的响应。这些研究结果为HSP70基因的功能分析以及花楸树的遗传改良奠定了理论基础。     

中国南瓜CmHSP90基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

热激蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)广泛介导胁迫信号的传递,在植物逆境应答反应中起重要作用。为探究HSP90基因的功能,该研究采用RT-PCR方法从中国南瓜(Cucurbitamoschata)幼苗中分离到2个HSP90基因的开放阅读框(ORF)全长,分别命名为CmHSP90-5和CmHSP90-6。二者的序列长度分别为2 357和2 472 bp,编码793和824个氨基酸。蛋白序列分析显示, 2个CmHSP90蛋白均属于亲水性蛋白,含信号肽,无跨膜区,结构上都含有典型的ATPase保守结构域,亚细胞分别定位于叶绿体和线粒体。同源比对和进化分析发现, 2个CmHSP90蛋白与苦瓜(Momordica charantia)、甜瓜(Cucumis melo)和黄瓜(Cucumis sativus)HSP90蛋白的相似性最高且遗传距离最近。qRT-PCR分析显示, 2个CmHSP90基因对高温、低温、ABA、高盐、H2O2、干旱和水杨酸(SA)等多种胁迫均具有明显的应答反应,但响应的速度和强度并不相同,其中对高温和水杨酸处理均表现出短时间强烈响应,推测CmHSP90基因可能在中国南瓜热胁迫和水杨酸信号途径中发挥调节作用。该研究结果为深入了解HSP90基因功能以及阐明中国南瓜的抗逆机制提供理论依据。     

石蒜核糖体蛋白L21的基因克隆及氨基酸序列分析

根据已知核糖体蛋白L21(RPL21)基因的保守序列设计1对引物,采用PCR技术从石蒜〔Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.〕叶片全长cDNA文库中筛选出阳性克隆。通过测序和分析,获得1条石蒜RPL21基因全长cDNA序列,命名为LrRPL21,GenBank登录号为FJ972626;序列全长709 bp,编码1条具有164个氨基酸残基的多肽。采用多种分析程序对石蒜RPL21的理化性质以及氨基酸序列的同源性进行了分析比较。结果显示:石蒜RPL21的预测分子量为18 628,理论等电点为10.36,分子式为C833H1348N254S4,总平均疏水性指数为-0.668,为亲水性蛋白;石蒜RPL21与其他8种植物RPL21的氨基酸序列同源性百分率均较高,达到85%～95%;根据系统树可推测其与油棕(Elaeis guineensis Jacq.)RPL21的进化关系最近。     

Molecular Cloning of OSP94: A Significant Biomarker Protein of Hypertensive Human Heart and a Member of HSP110 Family

Heat shock proteins (HSPs) are upregulated in response to stress and play a protective function in refolding of cellular proteins. In hypertension, the heart is a vital organ that requires examination and investigation, and primary induction of HSPs is predominantly effected. Hypertension results from osmotic imbalance during renin-angiotensin cycle inefficiency. Osmotic stress protein 94 (OSP94) is a stress protein induced upon osmotic imbalance. It is therefore necessary to analyze its precise role in the hypertensive heart. We have first reported the cloning and expression of human heart OSP94 followed by an analysis of gene sequence and protein homology. Directional cloning of OSP94 by PCR amplification yielded a 2.5 kb amplicon and was cloned into pET-15b. Site-directed mutagenesis was essentially followed. mRNA expression levels were evaluated in correlation with HSPs. Gene analysis indicated a 2520 bp sequence with an 838-amino acid protein complement. Protein homology revealed highly conserved sequence similarity among mammalian sequences. Structural predictions of OSP94 protein were also investigated. OSP94 is therefore recognized as a significant stress protein for investigations in hypertensive heart tissues and is a highly conserved protein in the HSP110 subfamily. Sequences deposited: EF 197155, NCBI GenBank Accession No. for OSP94 gene sequence; ABM 69040, NCBI GenPept Accession No. for OSP94 protein sequence.     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Pm-HSP70基因的克隆及其对温度胁迫的响应

本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝HSP70 (Pm-HSP70)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式。序列分析表明,Pm-HSP70 cDNA序列全长为2 215 bp,其中开放式阅读框1 899 bp,5'UTR 107 bp,3'UTR 209 bp,编码632个氨基酸,理论蛋白分子量为69.44 kD,理论等电点为5.61。该蛋白具有HSP70家族典型的结构域HSP70,以及ATP结合位点、细胞质特征性保守序列和3个HSP70家族标签。多序列比对结果表明Pm-HSP70与菲律宾蛤仔HSP70同源性最高,为80%;系统进化分析发现,Pm-HSP70与菲律宾蛤仔等贝类HSP70聚为一支。组织表达定量分析结果显示,Pm-HSP70在马氏珠母贝多个组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次是性腺;对不同温度下鳃组织中Pm-HSP70的时序表达分析发现,在处理后各时间点高温组(32℃)基因表达水平最高,且均显著高于对照组(22℃)和低温组(17℃)。以上结果表明Pm-HSP70可能参与马氏珠母贝的高温胁迫响应。该研究为进一步探索Pm-HSP70在马氏珠母贝温度适应性中的作用提供了基础资料。     

高山离子芥铁转运蛋白基因编码序列的克隆及其抗逆性表达的实时定量分析

铁转运蛋白 (iron transport protein,IRT)是具有跨膜运输离子功能的特殊蛋白质,属于金属离子转运家族的成员．本研究运用RACE方法从高山离子芥（Chorispora bungeana）中克隆得到完整的铁转运蛋白cDNA,命名为CbIRT（基因登录号为EU330924）．该基因全长1 290 bp,包含1个1 035 bp的开放阅读框（ORF）,编码344个氨基酸的蛋白．系统进化树分析显示,该基因与拟南芥AtIRT1和遏蓝菜TcIRT-G的亲缘关系最近,同源性分别达到了87.4%和86.5%,而在氨基酸序列水平与拟南芥AtIRT1的同源性达到了89%,表明克隆得到的CbIRT属于金属离子转运体家族成员．实时荧光定量方法对高山离子芥CbIRT基因在不同温度和铁营养水平条件下的表达情况进行分析表明,CbIRT对零下低温和零上低温的表达水平呈截然不同的反应;正常铁营养状态下,CbIRT是微量表达的,而缺铁及低温处理都可以大幅度地促进该基因的表达,富铁可以抑制该基因的表达．显示了该蛋白在转运Fe离子方面的重要作用．     

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE 技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4（GenBank 登录号为EU977182）。该基因全长2 182 bp,包含1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9 kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激（4℃）和热激（40℃）1 h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。     

花花柴KcbHLH71基因的克隆及表达分析

高温胁迫可引起植物体内生长素类激素含量和活性变化,也可影响其生理生化过程进而产生胁迫蛋白以提高自身抵抗或适应逆境的能力。根据高温胁迫下花花柴转录组测序分析结果,发现生长激素合成相关基因bHLH显著上调,通过PCR克隆获得该基因碱基序列,命名为KcbHLH71,并利用定量PCR对高温胁迫下该基因的表达模式进行分析。结果显示,花花柴KcbHLH71基因完整ORF为1 038 bp,编码345个氨基酸,分子量大小为38.8 kD,pI为6.8;编码蛋白含有b HLH蛋白家族的特征基序列和保守结构域,有信号肽,无跨膜结构,定位于细胞核。系统发育结果显示花花柴KcbHLH71与菊科的向日葵、莴苣bHLH71蛋白的相似性分别为88%和83%,即认为它们同源性最高,亲缘关系最近。表达分析结果显示,高温胁迫下,花花柴KcbHLH71基因2 h的表达量受到最大抑制,之后逐渐上升,当12 h时达到高峰,12～24 h再次出现下降,但仍高于对照水平。以上研究结果表明,高温可以显著诱导KcbHLH71基因的表达,推测该基因可能参与花花柴响应高温胁迫的正调控。     

Cloning and expression of HSP70 gene of sipuncula Phascolosoma esculenta

In this study the gene encoding HSP70 was isolated from Phascoloma esculenta by homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length of cDNA (2520 bp) consists of a 5′-terminal untranslated region (UTR) (125 bp), a 3′-terminal UTR (421 bp) with a canonical polyadenylation signal sequence (AATAAA), a poly (A) tail, and an open reading frame (ORF) (1974 bp). The predicted molecular mass and isoelectric point for HSP70 is 71.6 kDa and 5.15, respectively. BLAST analysis showed that P. esculenta HSP70 gene shared high similarity. Classical HSP signature motifs, ATP/GTP-Binding Site Motif A, Bipartite Nuclear Targeting Sequence, the cytosolic HSP70 could be expressed in Escherichia coli BL21. After purification, the recombinant pET-HSP70 protein was used to produce the polyclonal antibody in mice and the specificity of the antibody was confirmed by Western blot analysis. Fluorescent real-time quantitative PCR analysis showed that expression of Hsp70 in sipuncula was increased significantly after exposure to 10 mM Zn for12 h, Cd for 24 h, Cu for 48 h, and was exposure to 37 °C for 24 h sea water.     

砂梨CONSTANS基因的克隆及原核表达分析

为了探索梨树植物的开花调控机制,本研究以砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)叶片为材料,采用同源序列克隆法,进行了开花调控相关基因CONSTANS的克隆,命名为PyCO,GenBank登录号为KF246572。序列分析表明,该基因包含一个1023 bp的开放阅读框,编码340个氨基酸,推测蛋白质分子量为37.81 kD,等电点为5.95。PyCO蛋白具有典型的植物CO家族的结构特征,含有2个高度保守的B-box及CCT结构域。进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果的同源性接近93%,与碧桃、可可树、草莓等其他高等植物的CO类蛋白同源性也在70%以上。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白,分子量约为58.5 kD,为进一步探索梨树开花调控机理奠定了基础。     

三角帆蚌热休克蛋白60基因克隆及其表达分析

利用3'RACE技术, 对高通量转录组测序所得三角帆蚌HSP60基因（hcHSP60）长片段（2629 bp）进行了3'末端克隆, 经拼接得到hcHSP60 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcHSP60 cDNA全长序列进行了特征分析, 并采用RT-PCR技术检测了其组织分布及经冷热应激后的表达变化。结果显示, hcHSP60 cDNA全长为2807 bp, 其中开放阅读框为1707 bp, 编码568个氨基酸, 预测分子量大小为61.04 ku, pH 7.0时的理论等电点为5.63。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明, hcHSP60氨基酸序列与光滑双脐螺HSP60同源性最高（达82%）, 而与牙鲆、白云金丝鱼HSP60的同源性最低（为75%）。RT-PCR检测结果表明, hcHSP60在肝胰腺中的表达水平最高, 而在血液中的表达水平最低。30℃与35℃水温处理三角帆蚌4h后, 各组织中hcHSP60表达水平明显上升, 表明hcHSP60可能在三角帆蚌耐热应激反应中起着重要作用。       

美国白蛾热激蛋白70基因的鉴定及功能分析

[目的]探究热激蛋白70 (heat shock protein 70,HSP70)基因在美国白蛾Hyphantria cunea抵御高温胁迫过程中的作用,为揭示美国白蛾的扩散机制以及预测潜在分布区提供理论支撑.[方法]利用PCR技术克隆美国白蛾HSP70基因,并进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测新蜕皮的美国白蛾...