沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的耐寒性研究

以紫花苜蓿品种‘中苜2号’为野生型材料,采用农杆菌介导法将沙冬青脱水素基因(dehydrin,AmDHN)导入紫花苜蓿基因组中并获得转基因植株,通过PCR和Southern blot杂交鉴定转基因植株,利用RT-PCR和qRT-PCR检测转基因植株中AmDHN基因及低温胁迫相关基因的表达量,并测定低温胁迫下苜蓿叶片的脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量,从分子水平和生理指标两个层面研究转基因植株的抗寒特性,为进一步获得抗寒性较强的转基因苜蓿新材料提供依据。结果显示:(1)AmDHN基因已整合在转基因苜蓿植株基因组中,而且在不同的转基因株系中AmDHN的表达量也各不相同。(2)低温(4℃)处理后转基因植株中冷胁迫相关基因CBF2、CBF3、ProDH和CAS17的表达量明显高于同期野生对照;CBF2、CBF3和CAS17表达量在冷处理5h后都显著增加并达到最大值,而ProDH表达量在冷处理7d时最高,它们的最高值分别是对照的2.5、4、1.6和3倍左右。(3)苜蓿叶片的Pro和MDA含量均随低温处理时间延长而逐渐增加,转AmDHN基因苜蓿叶片的Pro含量始终高于同期野生型植株,而其MDA含量却始终低于同期野生型植株,且两类植株间差异均在胁迫14d时达到显著水平。因此,推测转AmDHN基因苜蓿中积累的AmDHN蛋白可能对一些酶的活性及膜系统起冷冻保护作用,从而使得转AmDHN基因紫花苜蓿的植株抗寒性提高,同时AmDHN也可能通过调控与低温相关基因的表达间接调节植物的耐低温能力。     

茶树叶片类脱水素蛋白的Western-blot分析

为了解茶树脱水素种类与功能,采用Western-blot技术,研究了不同季节及越冬过程中茶树叶片脱水素蛋白家族的表达模式。结果显示:(1)茶树叶片总蛋白提取采用酚-甲醇/醋酸铵沉淀法,用时短、蛋白浓度高、SDSPAGE电泳条带清晰,背景干净,满足茶树Western-blot技术要求。(2)在不同季节及越冬期中发现14~95kD共9种不同分子量的茶树类脱水素蛋白,其中95、65、48、37、34和14kD等6种蛋白表达量较为稳定,季节与越冬期变化不明显;58kD脱水素仅在冬季表达,越冬期不断上升,2月份增加到最高,表达丰度高;28kD脱水素蛋白在冬季表达量高,越冬期与茶树抗寒力变化规律一致;21kD脱水素在夏季和越冬期后期有较高的表达。研究表明,这3种脱水素可能在茶树抗逆中起着重要作用。     

羊草DHN3基因的克隆及其逆境响应的表达分析

该研究从羊草（Leymus chinensis）中克隆得到1个脱水素（Dehydrin,DHN）编码基因LcDHN3。通过序列分析表明,LcDHN3开放阅读框为501 bp,编码167个氨基酸,分子量为17.01 kD,理论等电点为8.05,为亲水性蛋白。LcDHN3蛋白具有脱水素的保守结构域,含有1个Y 片段、1个S 片段和2个K 片段,属于YSK2型脱水素。亚细胞定位预测LcDHN3蛋白定位在细胞质和细胞核。同源比对分析显示,LcDHN3与大麦（Hordeum vulgare）等6种植物的DHNs整体相似性为84.27%。进化分析显示,LcDHN3和大麦的DHN亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,LcDHN3基因的表达受干旱、冷、热、NaCl、高pH和机械损伤胁迫诱导,同时受植物激素ABA和JA的诱导。研究表明,LcDHN3参与了羊草响应逆境胁迫的信号途径。     

中间锦鸡儿DHN1基因克隆及表达分析

脱水素(DHNs, dehydrins)是LEA II亚家族蛋白,在种子发育后期大量积累,并受不同逆境胁迫处理诱导表达。在中间锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一段 DHN1 序列,利用RACE技术克隆获得基因全长序列。序列比对分析表明, CiDHN1 具有开放阅读框891bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码297个氨基酸,含有5个Y片段和一个K片段,与CiDHN1相似性最高的为山茱萸科主教红端木(Cornus sericea),相似性为39%。系统进化分析显示CiDHN1单独聚为一支,推测该蛋白为新的功能未知蛋白。亚细胞定位结果表明CiDHN1定位在细胞质、质膜和细胞核。荧光定量PCR结果显示 CiDHN1 的表达受冷、脱水和NaCl等非生物胁迫的诱导。 CiDHN1 过量表达拟南芥后,其中表达量最强的株系对200 mmol/L的NaCl处理较为敏感。CiDHN1在中间锦鸡儿抵抗逆境胁迫中的功能有待于进一步研究。     

新疆沙冬青叶片氨基酸和蛋白质的测试与分离以及抗冻蛋白的鉴定结果分析

提取并纯化了新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus)叶片总蛋白,得到了适合新疆沙冬青叶片总蛋白提取的最佳缓冲体系;用DEAE52-C分离了各蛋白质组分,并用SDS-PAG测定了纯度和分子量(14~90 kD之间);氨基酸组成分析显示了新疆沙冬青属内种遗传的一致性。对抗冻活性分析讨论证实了与蒙古沙冬青同属的新疆沙冬青中也含有抗冻蛋白(AFPs)。     

沙冬青脯氨酸转运体基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从沙冬青中克隆获得了脯氨酸转运体基因Am Pro T(Gen Bank登录号为KJ873133)。序列分析表明,Am Pro T基因开放阅读框为1 329 bp,编码442个氨基酸,预测蛋白质分子量为48.07 k D,等电点为9.32,含有11个跨膜区域,具有典型的脯氨酸转运蛋白的特征。进化分析显示,Am Pro T与大豆Pro T的相似性达到86%。荧光定量PCR分析表明,Am Pro T在地上部的表达量要显著高于地下部,在受到干旱、高盐、脱落酸胁迫后表达量呈上调趋势,推测Am Pro T可能在沙冬青响应干旱、盐等非生物胁迫过程中发挥作用。     

植物脱水素的结构和功能

脱水素（DHN）属于LEA蛋白（late embrygenesis abundant protein）第二家族成员,具有广泛的生物学功能,如防止细胞脱水,稳定细胞膜,结合金属离子,清除羟基自由基防止膜脂过氧化,保护冷敏感性酶活性,作为分子伴侣和结合DNA／RNA的特性等。本文介绍脱水素的结构,在植物器官、组织和亚细胞中的定位以及功能的研究进展。     

沙冬青属植物叶绿体基因组对比和系统发育分析

该研究以沙冬青和矮沙冬青叶绿体基因组为研究对象,比较分析其基因组结构和系统发育关系。结果显示: (1)沙冬青和矮沙冬青的叶绿体基因组具有典型的四段式结构,全长为153 935 bp和154 140 bp,其中大单拷贝区(LSC)分别为83 891 bp和84 126 bp,小单拷贝区(SSC)分别为18 022 bp和18 014 bp,以及长度各自为26 011 bp和26 000 bp的成对反向重复区(IRs);沙冬青和矮沙冬青均注释130个基因,包括85个蛋白编码基因(PCGs),37个转运RNA(tRNA)以及8个核糖体RNA(rRNA)。(2)沙冬青和矮沙冬青的叶绿体基因组中分别检测出26和15个回文重复序列,39和50个串联重复序列,23和34个散在重复序列。同时都鉴定出96个SSRs位点,包括74和73个单核苷酸重复,5和6个二核苷酸重复,以及各有17个复合SSR位点;边界分析显示两者IR区相似,但仍有一定差异。(3)通过近邻结合法(NJ)对沙冬青和矮沙冬青在内的17种蝶形花亚科以及2种云实亚科植物的叶绿体基因组构建的系统发育树显示,沙冬青和矮沙冬青以较高的支持率聚为一个独立分枝。该研究结果为沙冬青属的种间鉴别、SSR分子标记开发、保育工作、种群动态以及进一步研究坡塔里族的演化过程奠定了理论基础。     

沙冬青AmNAC6基因的克隆与功能初步分析

以强抗逆植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.)为材料,克隆获得一个NAC转录因子基因Am NAC6的全长cDNA,并对其序列特征、蛋白质亚细胞定位和表达模式进行了分析。研究结果表明,Am NAC6基因的编码蛋白由304个氨基酸组成,具有NAC家族典型的结构特征,亚细胞定位实验证实该蛋白分布于细胞核内。表达图谱分析结果显示,在室内培养的沙冬青幼苗中,Am NAC6的转录水平受干旱、高盐、低温和高温胁迫的影响,其中在干旱诱导下该基因的转录水平上调较为明显;野外生长植株的嫩叶中,该基因的转录水平在中秋和初冬略低于其他季节,春季则低于其在侧根、嫩枝、花蕾和未成熟果荚中的转录水平。此外,本研究还将Am NAC6基因成功地构建到植物表达载体。     

沙冬青AmCIP基因结构及其内含子生物信息学分析

旨在分析沙冬青Am CIP基因DNA序列结构特性及功能。以沙冬青Am CIP基因的c DNA序列设计引物,采用PCR扩增其DNA序列,并利用生物信息学方法分析基因的结构。序列分析表明,沙冬青Am CIP基因DNA序列长1 548 bp,包含2个外显子和1个内含子,Gen Bank登录号KU744005。在该基因的ORF内存在一个78 bp的内含子序列,同时内含子序列中含有参与厌氧诱导的类增强子元件(GC-motif)和光响应元件(TCCC-motif),3'-UTR区域含有多个参与光响应、胁迫响应和激素响应等相关的顺式作用元件,而5'-UTR区域只含有赤霉素响应元件(GARE-motif),这些元件可能对Am CIP基因转录表达起调控作用。此外,该基因具有较高的A+T碱基含量(64.7%),Am CIP的内含子不具有GT-AG规则的保守序列,即内含子5'碱基是GT,3'碱基是TG,推测Am CIP的m RNA具有独特的剪切机制。     

蒙古沙冬青群落区系组成及分类研究

蒙古沙冬青是西北地区珍稀濒危树种,探究区系组成和群落特征对于维持西北干旱荒漠区脆弱生态系统具有重要意义。该研究调查了26个蒙古沙冬青群落样地,采用TWINSPAN进行群落分类,同时利用典范对应分析(CCA)分析沙冬青群落物种组成与生态因子的关系,为珍稀濒危植物蒙古沙冬青的保护提供基础数据。结果表明:(1)蒙古沙冬青群落物种组成以豆科、禾本科、菊科和藜科植物为主,隶属于28科63属90种,区系组成以地中海、北温带分布及世界分布为主。(2)TWINSPAN等级分类可将26个蒙古沙冬青样地划分为9个群落类型,即蒙古沙冬青+蓍状亚菊群落、蒙古沙冬青+红砂群落、蒙古沙冬青+新巴黄耆群落、蒙古沙冬青+无芒隐子草群落、蒙古沙冬青+霸王群落、蒙古沙冬青+驼绒藜群落、蒙古沙冬青+白刺群落、蒙古沙冬青+沙鞭群落和蒙古沙冬青+毛刺锦鸡儿群落。(3)CCA排序分析显示,年均降雨量(F=2.8,P=0.002)、生长季降雨量(F=2.6,P=0.002)、速效氮(F=2.1,P=0.006)、太阳辐射量(F=2.1,P=0.008)、蒸汽压(F=1.9,P=0.006)、土壤有机质(F=1.7,P=0.04)、纬度(F=1.7,P=0.006)是影响蒙古沙冬青群落组成的主要生态因子。     

渗透胁迫下脱水蛋白DHN1在猕猴桃细胞中表达及亚细胞分布的动态变化

以绿色荧光蛋白(GFP)为报告分子, 通过构建DHN1-mGFP4融合蛋白表达载体, 研究了渗透胁迫条件下脱水蛋白DHN1的表达及其亚细胞分布的动态变化. 采用PCR方法在脱水蛋白基因dhn1两端引入XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点, 克隆到质粒pBIN-35S mGFP4, 构建DHN1-mGFP4融合蛋白表达载体, 并采用基因枪转化猕猴桃(A. delicisoa)悬浮细胞. 培养10 h后观察到高效表达的GFP绿色荧光, 绿色荧光只出现在细胞核内. 提高培养介质渗透势后, 可以诱导脱水蛋白向细胞质分布(主要集中在质膜周围), 并且增加介质渗透势可以明显缩短细胞质出现绿色荧光的时间. 蛋白合成抑制剂环己亚胺能够抑制细胞质绿色荧光的出现, 暗示细胞质出现的脱水蛋白是诱导产生的结果. ABA可以明显促进细胞质绿色荧光的出现, 并且随着介质渗透势的升高迅速缩短细胞质绿色荧光的出现时间.     

蒙药沙冬青的化学成分研究

从蒙古沙冬青分离得到了7个非生物碱类化合物,通过波谱学方法及与文献对照的方法鉴定为:β-谷甾醇(1)、白藜芦醇(2)、染料木素(3)、芒柄花素(4)、毛异黄酮(5)、maackiain(6)和trifolirhizin(7).其中化合物2、6和7为首次从蒙古沙冬青植物中得到.     

沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位

以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。     

干旱胁迫下耐旱性小麦在不同生育期脱水素的表达分析

以2种耐旱性不同的盆栽小麦陕合6号(干旱耐受型)和郑引1号(干旱敏感型)为材料,分别在其苗期、分蘖期、拔节期、开花期对土壤实施不同程度的自然干旱胁迫和复水处理,采用SDS-PAGE和Western blotting技术研究其叶片脱水素的表达规律,探究小麦整个生长期脱水素的表达与干旱胁迫的关系.结果表明:2种小麦的脱水素均仅在干旱胁迫时表达,其中45 kD和37 kD的脱水素在2种小麦的4个发育期的叶片中均有表达,28 kD的脱水素仅在特定发育时期表达.在干旱耐受型小麦(陕合6号)中,脱水素在胁迫初期少量表达,随着胁迫程度加剧表达量急剧增加,在重度干旱胁迫下达到峰值,复水后小麦叶片中脱水素含量迅速下降;在干旱敏感型小麦(郑引1号)中,脱水素在胁迫初期大量表达,中度胁迫表达量小幅度回落,到复水1 d达到峰值,此后随着复水时间增加小麦叶片中脱水素的量逐渐下降.研究表明,小麦叶片脱水素表达与干旱胁迫程度和生育期迫密切相关,不同耐旱型小麦材料中叶片脱水素表达的差异与品种之间的干旱耐受能力密切相关.     

丹参DHN1基因的克隆与序列分析

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge．)是一种重要的药用植物。以组织培养2～13w的丹参幼苗为材料,构建丹参cDNA库并进行大规模EST序列分析,所得序列经NCBI的BLAST工具分析,克隆号为rsmsxl-009377的序列与晚期胚胎丰富(Late Embryogenesis Abundant)基因家族Ⅱ中的成员有较高的同源性。根据其5’单向测序的结果设计引物“5'-GTGCGTAGACACATCGGTTC-3'”继续向3’测序,得到一个全长969bp的序列,序列分析发现该序列包含一个长690bp的开放阅读框(ORF),编码229个氨基酸,与NCBI注册的脱水素家族基因具有较高的同源性,且含有ⅡLEA蛋白的特征序列,表明本基因可能是一种新的脱水素基因,命名为DHN1,并住GENEBANK上进行了注册,序列号为：AY695932。     

沙冬青根瘤菌的抗逆性

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是西北荒漠地区珍稀常绿阔叶灌木,综合沙冬青分布区内气候、土壤和水分等因子,选取宁夏中卫县沙坡头、内蒙古磴口县、内蒙古阿拉善左旗、内蒙古乌拉特后旗作为样区,于2004年4月中下旬沙冬青的花期调查和收集根瘤,并结合地理环境对分离得到的根瘤菌进行抗逆性初步分析。调查发现根瘤的生成及其在宿主植物上的着生部位、大小、形状、颜色等因生境条件的不同而有所差异,水分是其主要的影响因子;分离得到根瘤菌17株,对其耐盐性、耐酸碱性、生长温度范围和抗生素抗性进行了研究。结果表明,64.7%的菌株可以在含3%NaCl的YMA培养基上生长;94.1%的菌株可以在pH 5~11的范围内生长;全部菌株在60 ℃处理10 min后仍能生长;不同菌株对不同抗生素表现出不同的抗性,ZW₄和WH₄¹对各抗生素表现出较强的抗性。分离自磴口县的根瘤菌普遍表现出较强的抗酸碱和抗高温的能力,这是对其环境的适应。本研究证明沙冬青根瘤菌具有较强的抗逆性,但菌株间存在差异,这可能是对沙冬青分布区多种景观生态类型的适应。同时测定了几种伴生植物中间锦鸡儿(Caragana intermedia)、猫头刺(Oxytropis aciphylla)和柠条(Caragana corshinskii)根瘤菌的抗逆性,与沙冬青根瘤菌表现出一定的相似性,具较强的抗逆性,说明生态环境对豆科植物-根瘤菌共生体有重要的影响。沙冬青的高抗性可能与沙冬青根瘤菌的高抗性有关。沙冬青与其根瘤菌的共生关系有利于其植物群落的发育和多样性的维系。     

青杨脊虎天牛CYP4G2基因片段的克隆、序列分析与表达

根据报道的十几种昆虫CYP4家族基因的氨基酸序列保守区域设计一对引物,利用RT-PCR技术扩增编码青杨脊虎天牛Xylotechus rusticus中肠细胞色素氧化酶CYP4G2蛋白的cDNA片段,构建原核表达载体pET-CYP4G2,将其转化入大肠杆菌Escherichia coli JM109中表达。序列分析结果表明,该基因(CYP4G2,GenBank登录号为EF429250)保守区域阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为16.9 kD和5.75;推导的氨基酸序列与已报道的昆虫CYP4家族氨基酸序列一致性较高（63%～86%）,且具有细胞色素氧化酶的典型特征。IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测到一条22 kD大小的外源蛋白,与预测融合蛋白的分子量大小相应。CO差光谱分析证明重组菌表达了有活性的pET-CYP4G2。     

食蟹猴疟原虫 (Plasmodium cynomolgi)中一个真核翻译起始因子4A(eIF-4A)同源蛋白的cDNA克隆、表达和ATP酶活性测定(英文)

真核翻译起始因子 4A(eukaryoticinitiationfactor 4A ,eIF 4A)是DEAD盒蛋白家族的ATP依赖性的RNA解旋酶类中的一个原型成员 .它在真核细胞的蛋白质合成的起始过程中起着关键性作用 .通过PCR扩增和放射探针杂交相结合的方法筛选食蟹猴疟原虫 (Plasmodiumcynomolgi)的cDNA文库 ,克隆了一个eIF 4A同源蛋白的完整cDNA序列 ,命名为CH1F .CH1F全长 1 75 3bp ,包含一个1 1 97bp的完整阅读框 ,推测编码一个由 398个氨基酸组成的蛋白 .对CH1F的蛋白序列用BlastP进行搜索和分析 ,提示它应该是DEAD盒家族的一个eIF 4A同源蛋白 ;用DNAStar将其与许多典型的DEAD盒蛋白序列进行比对分析 ,结果显示 :比起其它的DEAD盒蛋白 ,它与eIF 4A或eIF 4A的同源蛋白具有更高的同源性和更多序列上的相似结构域 .将包含完整阅读框的片段亚克隆进表达载体pET 2 8a (+) ,在大肠杆菌DH5α中表达 ,产生的融合蛋白大小在 4 5kD左右 .对该融合蛋白进行纯化、重新折叠和初步鉴定 .ATP酶活性检测显示 ,该融合蛋白只有很低的ATP酶活性 ,而且它的ATP酶活性似乎不依赖于核酸底物 .对这一检测结果给出 3种可能的原因 .这一检测结果与根据序列分析得到的推论———CH1F蛋白可能是一个eIF 4A并不矛盾     

沙冬青CBL1蛋白纯化及性质研究

CBL是近年来发现的一类钙信号转导蛋白,CBL-CIPK组成的信号通路在植物应答生物和非生物刺激中发挥重要作用。其中CBL1和相应的CIPK在低钾,渗透压,干旱,机械损伤,及冻伤等环境胁迫中发挥重要作用。通过对沙冬青CBL1表面带电氨基酸定点突变,表面赖氨酸甲基化后电荷消除证明了沙冬青CBL1(AmCBL1)在钙离子存在下的非特异性聚集是由于分子间的电荷相互作用引起,三体蛋白很可能是沙冬青CBL1蛋白发挥功能的单位。通过甲基化可以得到聚合状态均一的蛋白,为CBL1晶体生长奠定了基础。