水涝胁迫下辣椒转录组特征分析及EST-SSR标记开发

为开发适当的生物学工具以探索辣椒对水涝胁迫应答的分子机制,该研究对不同淹水处理的辣椒样本进行转录组分析,获得了丰富的序列数据,并在此基础上对SSR分子标记进行挖掘。结果表明:(1)辣椒转录组检测共获得128 939个Unigene,其总长度平均长度和GC含量分别是55 082 725、1 101 bp和40.57%。与七大功能数据库进行比较,分别有102 123个(NR: 79.20%)、110 157个(NT: 85.43%)、70 203个(SwissProt: 54.45%)、73 539个(KOG: 57.03%)、77 646个(KEGG: 60.22%)、77 442个(GO: 60.06%)以及68 216个(Pfam: 52.91%)个Unigene获得功能注释。发现脂质代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、环境适应、次级代谢物生物合成、信号转导和翻译等途径在辣椒水涝胁迫应答中起重要作用。(2)从辣椒转录组数据中发掘到26 574个SSR位点分布在24 889个Unigene中。SSR的出现频率为20.61%,其中单核苷酸重复所占比例(37.26%)最高,其次是三核苷酸(31.00%)和二核苷酸(25.44%)重复类型,三者占EST-SSR总数的93.70%。在单核苷酸与二核苷酸中最多的基序类型为A/T、AG/CT和TC/GA,然后是AT和TA; 三核苷酸中最常见的基序类型是TTG/CAA和ACA/TGT。(3)用Primer 3在线工具设计了10 002对EST-SSR引物,随机选择30对引物进行PCR扩增,均可获得有效扩增。对3份辣椒材料进行扩增,其中7对引物可以扩增出目标条带。综上所述,在辣椒中优势SSR重复类型的基序结构和其他品种基本相近,并初步探索了辣椒水涝胁迫应答的分子机制,开发了EST-SSR标记,为辣椒耐涝遗传育种提供了参考。     

杂交兰转录组SSR信息分析及EST-SSR标记开发应用

该研究主要开发筛选适用于杂交兰的EST-SSR引物,为杂交兰种质资源评价和遗传变异研究等提供可靠的分子标记。该研究对杂交兰进行转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并对不同种质的遗传多样性进行分析。结果表明,从31724条杂交兰Unigene中检测出18603个SSR位点,SSR出现频率为58.64%;SSR位点中的主导类型是单核苷酸重复,占总SSR的65.10%,其次是二核苷酸(23.56%)和三核苷酸(10.76%)重复;优势重复基元为A/T、AG/CT、AT/AT和AAG/CTT,分别占总位点的64.72%、13.74%、8.19%和2.51%。利用Primer Premier 5.0共设计了565对SSR引物,从筛选出的64对有效扩增引物中随机选择28对引物,对40份杂交兰种质进行多态性验证与遗传关系分析,其中16对(占57.14%)引物表现出可重复的高多态性,平均多态信息量(PIC)达0.789。基于扩增的多态性SSR信息,40份种质资源可聚为4类,聚类结果与其遗传背景基本一致。该研究印证了转录组测序获得的Unigene是SSR标记开发的有效来源,开发的EST-SSR引物可为杂交兰及近缘种的良种鉴别、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及功能基因挖掘等提供有价值的候选标记。     

黄秆乌哺鸡竹转录组EST-SSR分子标记开发与应用

基于黄秆乌哺鸡竹(Phyllostachys vivax McClure f. aureocaulis N. X. Ma)转录组数据,利用生物信息学方法分析其SSR位点分布特征,同时针对“黄秆”和“绿秆”两种类型差异表达基因序列中的SSR位点设计引物,并利用刚竹属(Phyllostachys)材料验证其通用性。结果显示,从黄秆乌哺鸡竹89 874个Unigenes序列中,共鉴定出12 651个SSR位点,分布频率为14.07%;其中单核苷酸重复基序最多(51.02%)、其次为3核苷酸(25.61%)和2核苷酸(21.94%);共发现80种重复基序,其中出现频率最高的为A/T(46.60%),其次是AG/CT(13.97%)和CCG/CGG(9.90%)。在设计的51对引物中,44对(86.27%)能有效扩增,在刚竹属材料中平均通用性为92.41%,其中39对具有多态性,多态性EST-SSR标记能区分同属的不同种,但不能有效区分种内种质资源。     

基于转录组测序的茄子SSR标记开发

应用Trinity软件对茄子转录组测序数据组装,得到总长度为47919660 bp的45404条Unigenes,MISA从中检索到8316个SSR位点,发生频率为18.32%,平均5.63 kb一个位点。SSR位点中单碱基重复类型最多,为5372个,占到64.60%;其次为三碱基重复1628个,占到19.58%。三碱基重复中AAG/CTT是优势重复单元,占三碱基重复数的31.6%;二碱基重复中AG/CT是优势重复单元,占二碱基重复数的42.3%。利用Primer 3设计引物,共得到858对SSR引物,随机选取100对引物对17份茄子材料进行扩增,结果表明:有84对可以扩增出条带清晰的片段,有47对引物扩增片段为多态性片段。对47对多态性引物进行分析,多态性信息含量范围为0.10~0.64,平均多态性信息含量为0.32,UPGMA聚类分析可将17份材料分为3类。以上结果表明,基于茄子转录组测序开发的SSR标记可以为茄子的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富的标记来源。     

基于转录组测序的枫香EST-SSR引物开发及有效性评价

枫香是广西重要的乡土树种之一，具有较高的用材、观赏及药用价值。为验证枫香SSR引物的实际应用效果，该研究基于转录组测序技术，检测枫香SSR位点并设计引物，通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出具有较高多态性的枫香EST-SSR引物，并对1个枫香天然群体进行遗传多样性分析。结果表明：(1)共发掘到23 777个SSR位点，单核苷酸重复类型SSR位点占总位点比例最高(46.54%),在重复次数上5～12次之间的SSR位点占比最高(72.36%)。(2)共开发出262对SSR引物，有效扩增率为53.1%,最终筛选出扩增稳定、条带清晰的引物18对。(3)多态性检测结果显示所有位点均具有多态性，天然群体遗传多样性结果显示该天然群体中等位基因数量(Na)、有效等位基因数量(Ne)、Shannon多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)变化范围分别为2～4、1.112 8～2.609 6、0.208 9～1.112 7和0.275 9～1.000 0,平均值分别为2.333 3、1.957 4、0.708 5和0.722 6。综上认为，枫香中占优势的SSR位点重复类型和重复基序与其他物种基本相同，所开...     

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证,为进一步SSR分子标记开发提供依据。对Hi Seq2000测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索,共获得45 706个SSR位点,出现频率为10.38%,平均4.30kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主,所占比例为56.47%;二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%;其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT;其次为3核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150对引物,通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证,其中有79对能获得扩增条带,21对引物扩增出单一条带,比例为14.0%。     

基于地黄转录组数据的SNP标记开发与地黄指纹图谱构建

地黄(Rehmannia glutinosa)是一种具有较高药用价值和经济价值的植物。准确的品种鉴定对地黄种质管理和育种至关重要,使用SNP分子标记来鉴定地黄种质和构建指纹图谱对地黄分子标记育种提供了新方法。利用地黄转录组数据和SRA数据库中的3个地黄转录组数据比对,寻找候选SNP,用PCR技术扩增和序列分析研究28个地黄品种候选SNP变异。从地黄转录组数据中获得了102 075条Unigenes,其中共有SNP位点35 339个,发生频率为0.51/kb;从中随机选取40个候选SNP位点,设计引物39对,用PCR和序列分析从中筛选出7对好的SNP引物,包含8个多态性好的SNP位点;利用最终筛选出的8个SNP位点构建地黄指纹图谱,可以将17个不同地黄种质区分开,可用于地黄种间和种内品种的鉴定。     

基于转录组数据的意大利蝗微卫星位点分析与分子标记开发

【目的】意大利蝗Calliptamus italicus (L.)是新疆荒漠半荒漠草原重要害虫。本研究利用已获得的意大利蝗转录组数据,鉴定其微卫星位点。【方法】使用MISA筛选SSR位点,利用Primer Premier 5设计引物,通过PCR扩增对引物进行验证。【结果】在意大利蝗转录组数据库中,共检测出156500个SSR位点,分布在126369条unigene中。其中,单核苷酸重复为60.88%,二核苷酸重复为23.58%,三核苷酸重复和四核苷酸重复分别为12.99%和2.04%。单核苷酸重复主要为A/T(44.38%),二核苷酸重复主要为AC/GT(12.99%)和AG/CT(8.05%)。基于筛选的SSR位点设计引物,随机挑选24对引物,对10个不同地理种群意大利蝗成虫DNA样品进行PCR扩增,共有6对引物扩增成功。【结论】本研究利用转录组数据发掘意大利蝗SSR位点,为意大利蝗分子标记、种群遗传及功能基因等研究奠定基础。     

基于转录组数据的齿缘刺猎蝽微卫星分子标记开发

【目的】齿缘刺猎蝽Sclomina erinacea是我国猎蝽科天敌昆虫常见种类,其不同地理种群存在明显形态差异。本研究旨在利用已经获得的齿缘刺猎蝽转录组数据筛选微卫星位点,为齿缘刺猎蝽种群遗传多样性和遗传分化研究开发可靠的微卫星分子标记。【方法】基于高通量测序技术平台Illumina HiSeq^TM 2000获得齿缘刺猎蝽转录组数据(42 215条unigenes),利用MISA软件进行搜索发掘SSR标记;利用Primer Premier 3软件设计SSR引物,从中随机选取54对SSR引物,利用PCR技术在中国齿缘刺猎蝽9个地理种群上进行验证。【结果】利用MISA软件搜索到微卫星位点2 395个,它们分布在2 107条unigenes上,其主要重复类型是三核苷酸重复(占总SSR的44.43%),其次是二核苷酸重复(占总SSR的40.08%),再次是四核苷酸重复(占总SSR的12.94%)。利用Primer Premier 3 软件成功设计出2 000余对SSR引物。随机选取的54对引物对9个齿缘刺猎蝽不同地理种群进行的SSR位点PCR扩增结果表明,共有16对引物较好地扩增出目的片段。【结论】研究表明利用齿缘刺猎蝽转录组数据可以大量发掘微卫星分子标记。本研究为进一步开展齿缘刺猎蝽的种群遗传学研究奠定了基础。     

基于转录组的白沙蒿SSR分子标记的开发

[目的]利用转录组数据开发白沙蒿的SSR分子标记,探索其分布特点并对SSR引物进行有效性检测。[方法]以9个不同样品白沙蒿转录组数据为基础,利用MISA软件对1kb以上的Unigenes进行筛选;把重复序列单元相同、重复次数存在差异、侧翼序列长度完全相同的SSR位点作为引物合成的标准,采用PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其有效性进行初步验证。[结果]在20 149条Unigenes中共检测出5 692个SSR位点,发生频率为22.95%,平均每隔6.66 kb出现1个位点。优势重复单元单、三、二核苷酸分别占总SSR位点的52.09%、28.30%和17.38%。经过验证筛选出具有多态性且扩增条带清晰的引物18对。[结论]印证了利用白沙蒿转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,且开发的有效SSR引物可用于后续群体的相关研究中。     

基于转录组测序信息的水生植物蕃菜SSR标记开发

利用软件MISA对水生植物蓄菜转录组测序所获得的79536条EST序列进行分析,共检测出12319个EST—SSR位点。在蓄菜的EST—SSR中,二核苷酸和三核苷酸重复单元是主导类型,分别占总SSR的57．31％和30．87％,其中AG／CT、AAG／C1_r分别是二、三重复单元类型的优势重复基元,分别占总SSR的29．76％和8．66％。随机挑选了130对EST-SSR引物对蓄菜两个居群进行遗传多样性检测,结果发现：78对引物能扩增出清晰可分辨的条带,其中37对能成功检测出多态性,引物多态率为47．44％。这些多态性引物共检测出114个等位基因,每个位点2—6个,平均3．08个。观测杂合度（心）及预期杂合度（He）分别在0．229～1．000和0．351-0．756之间,多态信息含量PIC值在0．286～O．698之间,平均达0．495。以上研究结果表明,通过萏菜转录组测序产生的EsT数据来开发SSR标记是一种简单而高效的途径,这些新的SSR分子标记为研究苔菜的居群遗传多样性及其遗传结构提供了工具。     

基于转录组序列的长柄双花木SSR标记开发

双花木属(Disanthus Maxim.)是金缕梅科(Hamamelidaceae)最原始的单种属,为东亚地区特有属。长柄双花木(D.cercidifolius var.longipes H.T.Chang)是日本特有植物双花木(D.cercidifolius Maxim.)的变种,仅分布于我国南方地区,为国家Ⅱ级保护植物,被列入我国濒危植物种名录,在研究金缕梅科系统发育和东亚植物区系地理演化等方面具有重要的科学价值。由于可利用的SSR标记引物数量不足,阻碍了长柄双花木遗传学研究。本研究对长柄双花木转录组序列进行高通量测序,采用de novo组装方法,共获得32325条unigene。利用MISA软件,搜索到13779个SSR位点,SSR位点发生频率为42.63%,位点分布频率为1/2.95 kb。不同重复基序类型中,二核苷酸重复基序数量最多,占总数44.10%;单核苷酸重复基序次之,占总数37.90%;三核苷酸重复基序,占总数16.71%。二核苷酸重复基序中,AG/CT重复基序数量最多;三核苷酸重复基序中,AAG/CTT重复基序数目最多,其次是ATC/ATG、ACC/GGT和AGC/CTG。从不同种群中任取1株构成8株无亲缘关系的随机样本,对随机合成的60对SSR引物的有效性进行琼脂糖电泳检测的结果表明,46对引物扩增出目的条带,扩增率达76.67%。进一步利用TP-M13-SSR技术基因分型结果显示,30对引物扩增产物显示出多态性,多态位点百分比为65.22%。这表明,基于转录组序列开发的长柄双花木SSR位点多态性较高。本研究结果有助于后续的长柄双花木种群遗传学及系统进化等方面研究。     

基于枇杷转录组序列的SSR分子标记引物开发

为获得更多的枇杷SSR引物,对枇杷转录组测序得到的1 kb以上的11 798条Unigenes进行SSR位点搜索。结果在3515 条Unigenes（6.77%）中共获得4438个SSR位点,其中主要重复类型为双碱基重复和三碱基重复,二者占SSR总数的68.27%,而四、五、六碱基重复类型较少,仅占1.42%。对选出的SSR标记采用Primer3进行引物设计,得到7911 对SSR位点特异引物,可用于枇杷遗传多样性分析、分子标记辅助育种、育种群体的建立等研究。     

思茅松转录组SSR分析及标记开发

基于思茅松转录组测序数据进行其SSR标记开发,为丰富思茅松SSR数据库提供参考。采用MISA软件对思茅松59 636条Unigene进行SSR搜索,共获得3 745个SSR位点,分布频率为6.28%,平均11.36 kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以三核苷酸基序为主,其次是二核苷酸基序,所占比例分别为49%和24%,其主要重复单元分别为AGC/CTG和AT/TA。随机挑选224个位点进行引物设计及合成,琼脂糖凝胶检测发现其中29个位点具有多态性且效果良好,但仅12个位点符合SSR重复类型的倍数大小且扩增效率高于85%。利用这12对荧光标记引物,对2个居群42份样本进行遗传多样性分析,共检测到35个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.093 2-0.480 9,平均为0.306 9。4个位点为低度多态位点(0PIC0.25),8个位点为中度多态位点(0.25PIC0.5)。这12个标记可用于思茅松遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及克隆等研究,旨为思茅松分子标记辅助育种及变异水平等研究提供技术支持。     

基于转录组数据的杜仲红叶性状SSR分子标记分析

对‘华仲12号’杜仲的幼嫩叶片（绿色）和成熟叶片（红色）及‘华仲11号’杜仲成熟叶片（绿色）进行转录组测序,进行测序数据的拼接和组装,且对转录组获得的基因（Unigenes）进行SSR分析。研究得到54 517条平均长度为806.90 bp的Unigenes,其中25 993条Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG蛋白数据库获得功能注释,占所有Unigenes的47.68%。参照KEGG数据库,可将注释到的6 910条Unigenes划分到122个代谢途径分支,其中花色苷代谢途径相关酶基因39个,类黄酮代谢途径38个,类胡萝卜素合成途径34个。54 517条Unigenes中共包含17 010个完整型SSR位点,占总SSR位点的96.28%。完整型SSR位点共包含67种重复基元,其中出现频率最高的重复基元类型为单核苷酸重复中的A/T （7 747个）,其次是AG/CT （5 039个）和AT/AT （850个）从花色苷代谢途径、类黄酮代谢途径及类胡萝卜素代谢途径中共找到13个SSR位点。为今后杜仲遗传多样性分析、遗传图谱构建及杜仲红叶性状分子标记开发等方面奠定了分子基础。     

植物EST-SSR标记开发及其应用

随着生物科技的进步,大量的植物表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)已经成为开发SSR标记的重要资源。EST-SSR作为一种新型分子标记,其多态性可能与基因功能直接相关,而且在相近植物间具有良好通用性,使得EST-SSR标记在实际应用中更具价值。采用计算机方法大规模发掘EST-SSR多态性位点极大地提高了SSR标记开发效率。尤其随着新一代测序技术的成熟以及测序成本的急剧下降,利用新一代测序技术产生大量的转录组数据进行EST-SSR多态性标记的计算机大规模发掘将对SSR标记的开发带来深远影响。本文简要介绍了植物EST-SSR分布特点,并对EST-SSR标记开发现状以及相关应用作了综合评述,此外,还对EST-SSR标记的计算机开发新策略进行了展望。     

基于转录组测序信息的水生植物莕菜SSR标记开发

利用软件MISA对水生植物莕菜转录组测序所获得的79536条EST序列进行分析,共检测出12319个EST-SSR位点。在莕菜的EST-SSR中,二核苷酸和三核苷酸重复单元是主导类型,分别占总SSR的57.31%和30.87%,其中AG/CT、AAG/CTT分别是二、三重复单元类型的优势重复基元,分别占总SSR的29.76%和8.66%。随机挑选了130对EST-SSR引物对莕菜两个居群进行遗传多样性检测,结果发现：78对引物能扩增出清晰可分辨的条带,其中37对能成功检测出多态性,引物多态率为 47.44%。这些多态性引物共检测出114个等位基因,每个位点2~6个,平均3.08个。观测杂合度（H_o）及预期杂合度（H_e）分别在0.229~1.000和0.351~0.756之间,多态信息含量PIC值在0.286~0.698之间,平均达0.495。以上研究结果表明,通过莕菜转录组测序产生的EST数据来开发SSR标记是一种简单而高效的途径,这些新的SSR分子标记为研究莕菜的居群遗传多样性及其遗传结构提供了工具。     

梅EST-SSR标记的开发及利用

利用MISA软件对10 123条梅EST序列进行SSR位点查找,得到含SSR位点的序列935条,SSR位点1233个,平均每100条EST序列中含有12.18个SSR位点.2核苷酸、3核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占35.52%和41.36%.设计了40对EST-SSR引物并进行扩增,有24对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中17对引物具有较好的扩增多态性.测序后发现13对引物中有73.08%的片段具有相应的SSR位点,对杏DNA指纹中部分谱带的测序结果也证明了是梅扩增出的相应的SSR位点.根据本研究含有SSR位点的测序结果推算,从梅EST中开发真实SSR位点的数目为901.随机选择13对引物对杏和梅进行DNA指纹构建与遗传多样性分析,结果发现,来源于梅的EST-SSR引物在杏中有很高的通用性,这些引物把梅和杏分成了两大群体,说明他们是遗传差异明显的两种植物.     

燕麦EST-SSR标记的开发和利用

为拓展分子标记在燕麦种质资源分析与鉴定中的应用,利用公共数据库中的25376条EST(expressed sequence tags)序列,开展了燕麦EST-SSR功能性标记的开发和利用研究。25376条EST序列经拼接去冗余后获得了11618条序列,从中筛选出含有不同重复基元的SSR且重复次数较多、长度较长的556条EST序列进行引物设计,开发了50对燕麦EST-SSR引物,通过筛选得到40对有效的EST-SSR引物。选取其中4对引物对5个燕麦种质资源进行了PCR扩增及产物测序,结果表明扩增条带多态性是由SSR差异造成的。利用40对ESTSSR引物对15个六倍体燕麦种质资源进行遗传多样性分析,共扩增出89个等位基因,平均每对引物产生2.23个等位基因;UPGMA聚类分析表明,15个六倍体燕麦种质资源在Dice系数为0.93处聚为3支,基本上是按照不同种进行聚类的,在相同种中又根据地理来源分别聚集成支。利用40对EST-SSR引物对31个遗传背景不清的燕麦种质资源进行基因组倍性鉴定,发现这些种质中可能存在有四倍体和二倍体的燕麦新资源。本研究开发的燕麦EST-SSR功能性标记将在燕麦遗传多样性分析、遗传图谱构建及燕麦属内种间基因组鉴定等方面发挥重要作用。     

橡胶树EST-SSR标记的开发与应用

通过对橡胶树10 778条EST序列进行拼接, 共得到Unigene 3 090条, 从中发掘出分布于353条Unigene的430个EST-SSR位点, SSR发生频率为11.42%, 平均分布距离为3.93 kb。在橡胶树EST-SSR中, 二核苷酸和三核苷酸重复是主要的重复类型, 分别占63.49%、32.09%。TC/AG、CT/GA和CTT/GAA、AAG/TTC、AGA/TCT是二、三核苷酸的优势重复类型。利用PRIMER5.0设计引物148对, 随机挑选21对引物进行合成, 并用其中15对扩增较好的引物, 通过变性聚丙烯酰胺凝胶结合银染的方法对44个橡胶树无性系进行了遗传多样性检测, 构建了聚类分析树状图。研究结果表明, 从橡胶树EST中开发SSR标记是有效、可行的, 文章所开发的EST-SSR引物可用于橡胶树遗传分析研究。