南美蟛蜞菊内参基因Actin的克隆及其分析

看家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参基因.为研究其他基因在南美蟛蜞菊响应环境变化的表达调控机制,根据GenBank上已登录的肌动蛋白基因(Actin)的同源核苷酸保守序列,设计特异性引物,利用RT-PCR的方法克隆获得了南美蟛蜞菊Actin基因的全长序列,并将该序列命名为WtAct.序列分析结果表明W...     

花椰菜BobACT基因的克隆及其作为内参基因的研究

实时荧光定量PCR技术是探索植物基因功能和调节机理的有效手段。选择合适的内参基因是获得实时荧光定量PCR准确性数据的必备条件。ACT基因高度保守且表达稳定,常作为内参基因被广泛应用。为了获得花椰菜ACT基因,以转录组测序和RT-PCR方法为手段克隆得到花椰菜肌动蛋白基因Actin。该基因等电点为5.395,理论分子量为41.77 kD;其cDNA开放阅读框长1134 bp,编码氨基酸377个,GenBank登录号为MG598643。Wolf Psort分析发现,BobActin蛋白亚细胞定位于细胞质基质中。Motif Scan分析显示,BobActin蛋白质的氨基酸序列4～377位为Actin保守结构域。进化分析表明,同源序列基因编码的蛋白质与同为十字花科的甘蓝、芜菁和油菜同源蛋白的相似性达到90%以上,具有高度的保守性。在此基础上,设计了1对荧光定量PCR引物,分析显示,该引物具有较高的特异性和扩增效率,在花椰菜根、茎、花、花球、叶片等不同组织和低温、高温、盐处理、干旱处理、ABA处理等胁迫处理下均能稳定表达,适合在花椰菜基因表达研究中作为内参基因,为开展花椰菜重要功能基因的挖掘、表达模式以及调控机理的研究提供参考。花椰菜在内参基因方面的研究还处于初步阶段,今后可继续克隆其他内参基因,丰富花椰菜的内参基因库,从而进一步提高花椰菜基因表达分析研究的稳定性、重复性和准确性。     

孟氏隐唇瓢虫qRT-PCR分析中内参基因的筛选

选择合适的内参基因是qRT-PCR研究的关键。本文以孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant为研究材料,利用qRT-PCR技术,对孟氏隐唇瓢虫4个候选内参基因Actin、RPS23、GAPDH和β-tubulin的mRNA的表达量进行了分析,并用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件分析它们在孟氏隐唇瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织中的表达稳定性。结果表明,以成虫不同组织为材料时,综合三种软件分析结果显示4个候选基因表达稳定性平均等级值排名为RPS23(rank=1)β-tubulin(rank=2.3)GAPDH(rank=3)Actin(rank=3.7),以不同发育时期虫体为材料时,综合分析结果显示4个候选内参基因表达稳定性平均等级值排名为RPS23(rank=1.7)Actin(rank=2)GAPDH(rank=2.7)β-tubulin(rank=3.7)。综合分析在瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织两种处理下,三种软件的评价效果,4个候选基因表达稳定性等级值的总平均排名为RPS23(rank=1.3)Actin(rank=2.8)=GAPDH(rank=2.8)β-tubulin(rank=3)。RPS23在瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织中均显示出较高的表达稳定性及与其它基因之间极大的相关性,可以确定为孟氏隐唇虫不同发育阶段及成虫不同组织基因表达分析中一个稳定表达的基因,可作为单个内参基因或者其它内参基因的协同基因,本实验为开展孟氏隐唇瓢虫功能基因表达分析奠定了方法学基础。     

水稻虫害诱导相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

实时定量PCR技术广泛应用于植物功能基因转录水平变化的研究, 选择合适的内参基因进行相对定量分析是实验结果准确的关键因素。通过分析5个常用的内参基因(eEF-1α、18S rRNA、25S rRNA、Actin和UBQ5)在水稻(Oryza sativa)经过各种处理后表达的稳定性, 结果表明, 水稻经过机械损伤处理后eEF-1α基因的表达最稳定; 二化螟处理后25S rRNA基因的表达最为稳定; 稻纵卷叶螟处理后Actin基因的表达最稳定; 两种刺吸式口器昆虫褐飞虱和白背飞虱危害后, UBQ5基因的表达最稳定。同时, 利用OsHI-LOX基因在不同处理后的表达来评价这些内参基因。研究结果为水稻虫害诱导实时定量PCR分析中内参基因的选择提供了理论依据。     

小桐子低温胁迫下microRNA实时荧光定量PCR内参的筛选与比较

选择合适的内参对实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果的准确性极其重要,在microRNA(miRNA)的qRT-PCR分析中尤为如此。通过筛选适宜分析小桐子低温胁迫下miRNA定量表达的内参,为小桐子及其他物种mi RNA的qRT-PCR分析提供有用的理论参考。基于以前的小RNA-seq结果,以低温处理的小桐子为材料,挑选11个候选内参基因,用实时荧光定量PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,表达最稳定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值为23左右,表达丰度适中;U6的Ct值为10左右,表达丰度高;因此,miR6448可作为小桐子低温胁迫下表达丰度适中的miRNA qRT-PCR的内参基因;U6可作为小桐子低温胁迫下丰度较高的miRNA qRT-PCR的内参基因。     

黄花大苞姜花药发育qRT-PCR内参基因筛选

qRT-PCR技术具有定量准确、灵敏度高、重复性好等特点,被广泛用于基因表达分析。内参基因的稳定性对于准确分析实验结果非常重要。该研究以黄花大苞姜(Caulokaempferia coenobialis)花粉母细胞时期(PMC)、四分体时期(TET)、成熟花粉时期(MP)的花药组织为材料,基于3个阶段花药转录组表达谱数据以及常用传统内参基因,筛选出Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Malate dehydrogenase(MDH)、α-tubulin3(TUA3)、β-tubulin7(TUB7)和Actin6(ACT6)作为候选内参基因,进行qRT-PCR分析;并运用BestKeeper、geNorm和Normfinder软件综合分析5个候选内参基因在黄花大苞姜花药发育过程中的表达稳定性。结果表明:MDH和TUB7的表达最稳定,ACT6的稳定性最差;分别以MDH和TUB7作为内参,分析GBE1在黄花大苞姜花药发育中的表达模式,并与该基因在花药转录组中的表达模式做相关系数分析,3种表达模式结果一致,进一步验证了MDH和TUB7的表达稳定性。这说明MDH和TUB7适合作为qRTPCR分析黄花大苞姜花药发育过程中相关基因表达模式的内参基因。该研究结果为黄花大苞姜花药发育分子机制相关研究奠定了基础,也为姜科花药发育相关内参基因的选择提供了参考。     

松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选

【目的】本研究拟选择适合用于分析松墨天牛Monochamus alternatus化学感受组织中基因表达的内参基因。【方法】依据转录组测序结果进行内参基因鉴定,利用RT-q PCR技术分析内参基因在松墨天牛不同发育阶段和不同性别化学感受组织间的表达差异,并利用软件ge Norm,Norm Finder和Best Keeper比较其表达的稳定性。【结果】松墨天牛转录组中鉴定出9个候选内参基因(Actin,TUB,18S rRNA,RPS27A,RPS3,RPL10,AK,GAPDH和EF1A),其中后7个候选内参基因在松墨天牛中被首次鉴定,松墨天牛候选内参基因和其他昆虫相应基因的同源性很高。9个候选内参基因引物均具有良好的扩增效率,18S rRNA的表达水平最高,EF1A的表达水平最低;18S rRNA和Actin在不同样品间的表达水平差异最大,GAPDH和TUB表达水平在不同样品间差异最小。ge Norm和Norm Finder软件分析认为,GAPDH是最稳定的内参基因,TUB是较为稳定的内参基因,18S rRNA和Actin是最不稳定的内参基因;Best Keeper软件分析认为,GAPDH和TUB是合适的内参基因,18S rRNA和Actin是不适合的内参基因。最适合校正松墨天牛化学感受组织中基因表达数据的内参基因数量为2个,即GAPDH和TUB,并且这样的内参基因组合可以用于不同发育阶段和不同性别的不同化学感受组织。【结论】本研究结果为利用RT-q PCR技术准确分析松墨天牛和其他天牛基因包括化学感受组织基因相对表达量的内参基因选择提供了重要参考。     

不同温度胁迫下瓜实蝇RT-qPCR内参基因筛选

特定条件下稳定表达内参基因的筛选是利用实时荧光定量PCR研究基因表达的关键基础。本研究以不同温度胁迫后后的瓜实蝇Bactrocera cucurbitae 2龄幼虫、雌虫和雄虫为试验材料,对其9个候选内参基因表达进行了RT-qPCR分析,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Ref Finder 4款软件分析各候选内参基因在3种虫态中的表达稳定性。结果表明,18S rRNA基因Ct值(≤5)较小,不适合作为内参基因使用,其它8个内参基因在瓜实蝇2龄幼虫中的稳定性排序为Rp L32 RPS13 TBPβ-tubulin TUBE Actin2 G6PDH Actin3。雌虫表达稳定性由高到低为:RPS13 Rp L32β-tubulin TBP TUBE Actin2 Actin3 G6PDH。雄虫表达稳定性为Rp L32 RPS13β-tubulin TBP TUBE Actin2 G6PDH Actin3。ge Norm软件分析各个虫态内参基因最佳组合均为2个。RPS13和Rp L32组合可作为瓜实蝇不同虫态下温度胁迫后的内参基因。     

实时荧光定量PCR分析蒙古韭低温诱导叶片中内参基因的选择

实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)是广泛应用于基因表达分析的实验技术。在基因表达分析过程中,选择稳定表达的内参基因对实验结果的准确性非常重要。以低温诱导24 h和72 h蒙古韭(Allium mongolicum)的叶片为材料,无处理0 h叶片为对照,使用荧光定量PCR法分析了Am5S-rRNA、AmActin、AmGAPDH和AmEF1-α4个看家基因的表达情况。通过ge Norm和NormFinder程序分析,发现AmGAPDH稳定性最好,Am5S-r RNA和AmActin次之,AmEF1-α稳定性最差,因此选择AmGAPDH作为蒙古韭基因表达分析的内参基因。本研究通过qRT-PCR方法分析稳定表达的内参基因,对后续蒙古韭低温诱导基因表达分析有重要的意义。     

小花棘豆内生真菌内参基因的筛选及其Sac表达分析

为了筛选小花棘豆Alternaria oxytropis内生真菌最稳定的内参基因,以小花棘豆内生真菌OW7.8菌株为研究对象,ACTIN、TUB、GAPDH、APRT、18S rRNA为候选内参基因,利用qRT-PCR技术,GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件共同评价候选内参基因的表达稳定性;以培养基中分别添加苦马豆素合成前体化合物赖氨酸(L-Lysine acid,L-Lys)、α-氨基己二酸(L-2-Aminoadidpic acid,L-A)和哌啶酸(L-Pipecolic acid,L-P)的不同生长时间的菌株为实验组,不添加为对照,利用qRT-PCR对真菌酵母氨酸还原酶基因(saccharopine reductase gene,Sac)表达分析。研究表明,Actin为表达最稳定的内参基因,实验组Sac表达量均高于对照组;3种前体化合物均促进Sac的表达,其中添加L-P的真菌Sac表达量最高,生长32 d的真菌的表达量达到最大值;添加L-A和L-Lys的真菌Sac表达量分别在生长第26天和第23天达到最大值。本研究结果为探索Sac对苦马豆素合成的影响提供了基础理论数据。     

建兰Actin基因cDNA全长的克隆及其表达分析

根据单子叶植物的肌动蛋白基因(Actin)的保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术从建兰(Cymbidium ensifolium)中分离出Actin基因cDNA全长.序列分析结果表明,建兰Actin基因长度为1 434 bp,编码区长度为1 134 bp,编码377个氨基酸,将其命名为CeActin,GenBank登录号为JN613147.CeActin推导的氨基酸序列与其他植物的同源性都较高,具有高度的保守性.采用半定量RT-PCR技术分析CeActin在建兰各组织及花不同发育时期的表达情况,结果表明,表达量没有明显差异,表明CeActin基因可作为内参基因.     

红掌佛焰苞基因qRT-PCR分析中内参基因的筛选

为筛选红掌(Anthurium andraeanumLinden)中稳定表达、可用于佛焰苞中实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)的内参基因,对5个组成型表达基因EF1-a、UBQ7、ACTB、GADPH、His3进行表达稳定性分析,并利用所筛选的内参基因研究红掌的二氢黄酮醇还原酶基因(dfr)的表达水平。结果表明,5种内参基因在不同品种间的表达稳定性不同。据内参基因标准化因子的配对差异分析(Vn/n+1),判定内参基因的最适数目为2,ACTB和UBQ7在红掌不同品种及佛焰苞发育不同阶段中表达均稳定,是理想的内参基因。dfr在不同品种的佛焰苞及佛焰苞发育过程中均有表达,且dfr表达水平的变化趋势一致,因此,所选内参基因是合适的。     

低温弱光对黄瓜幼苗Rubisco与Rubisco活化酶的影响

以‘津优3号'黄瓜幼苗为试材,研究弱光(100 μmol·m-2·s-1)下适温(WL:25℃/18℃)、亚适温(ST+WL:18℃/12℃)和低温(LT+WL:10℃/5℃)对黄瓜幼苗光合速率(Pn)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)、Rubisco活化酶(RCA)活性及其基因表达量的影响.结果表明:与对照(25℃/18℃,400 μmol·m-2·s-1)相比,WL、ST+WL和LT+WL处理的单株叶面积和干物质量均明显减小.处理初期,Pn、Rubisco活性及其大亚基基因(rbcL)、小亚基基因(rbcS)表达、RCA活性与基因(CsRCA)表达量大幅度降低,5～7 d后,WL处理趋于平稳,ST+WL处理缓慢回升,而LT+WL处理持续下降,表明黄瓜光合机构对适温弱光和亚适温弱光环境有逐步适应机制.Rubisco和RCA活性及其基因表达对低温弱光的响应与Pn基本一致,表明低温弱光下RCA和Rubisco活性及其基因表达量下降是黄瓜幼苗Pn降低的重要原因.     

qRT-PCR分析鳜鱼内参基因的筛选

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)准确性的首要条件。本实验采取鳜鱼8个不同胚胎发育阶段、5个胚后发育时期和8个成鱼组织为研究对象,应用qRT-PCR技术,分析了RPL13、RPL19、EF1a、RPL13a、B2M、hprt1和rps29七个内参基因的表达稳定情况。经GeNorm软件分析发现,B2M和RPL13a在鳜鱼成鱼不同组织中表达最稳定;在胚后不同时期中表达最稳定的是EF1a和RPL13a;EF1a和B2M是在不同胚胎发育阶段中表达最稳定的两个基因。根据内参基因标准化因子的配对差异分析V_(n/n+1),在鳜鱼不同组织和不同发育阶段中,均使用两个最稳定表达的内参基因即可达到准确校正的目的。因此,该实验结果为鳜鱼基因表达分析时内参基因的选择提供了参考。     

紫玉兰‘红元宝'花芽分化阶段基因定量分析的内参基因筛选

为筛选紫玉兰‘红元宝’(Magnolia liliflora‘Hongyuanbao’)二次花芽分化阶段稳定表达的内参基因,该研究以‘红元宝’不同花芽分化时期的花芽和叶为材料,基于转录组数据,筛选出8个候选内参基因,即泛素酶基因(UBC)、肌动蛋白(ACT)、微管蛋白β链(β-TUB)、微管蛋白β-5链(β-TUB5)、微管蛋白α-3链(α-TUB3)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、酰基载体蛋白2(ACP2)、酰基载体蛋白3(ACP3)。运用Primer Premier 5设计引物,简单克隆和熔解曲线验证引物特异性;利用qRT-PCR技术检测各个候选内参基因的表达情况,结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件和RefFinder在线工具综合评估其表达稳定性,并通过目的基因TFL1的表达分析验证其可靠性。结果表明:(1)8个候选内参基因条带位置正确,熔解曲线呈单一峰,说明引物特异性良好。(2)β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘红元宝’不同花芽分化时期较为稳定的内参基因,而UBC和ACT为稳定性最低的内参基因。(3)β-TUB5、α-TUB3、β-TUB及其组合的相对表达量趋于一致,而ACT和UBC并未对目的基因的表达量进行有效的标准化。因此,β-TUB、β-TUB5和α-TUB3可作为‘红元宝’二次花芽分化研究中稳定表达的内参基因。该研究结果将为木兰属植物二次成花分子调控机制研究提供依据。     

光处理下粘虫头部组织定量PCR分析中内参基因的筛选

[目的]筛选不同光处理下粘虫Mythimna separata稳定表达的内参基因,为基因定量研究提供基础.[方法]以粘虫头部组织为材料,选取18s rRNA、EF-1α、β-actin、GAPDH和AK5种候选内参基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析,然后通过△Ct法,BestKeeper、GeNorrn、Normfinder和RefFinder软件对候选内参基因的稳定性进行分析;利用GeNorm软件进行基因配对差异分析,以判断内参基因的最适组合.[结果]5种候选内参基因的Ct值都处于15-28之间.4种软件对5个候选基因稳定性的分析结果存在一定差异.综合分析各种软件的分析结果,推荐粘虫成虫不同光处理条件下采用AK和GAPDH作为内参基因.[结论]根据特定试验体系选择合适的内参基因对于qRT-PCR定量结果的准确定和可靠性具有重要意义.本研究对后续粘虫在不同光处理条件下目标基因的准确定量具有重要意义.     

梨小食心虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】本研究旨在探明梨小食心虫Grapholita molesta在不同发育阶段、成虫不同组织以及不同浓度的3种杀虫剂处理后成虫中稳定表达的内参基因,为后续对梨小食心虫目的基因表达的研究奠定基础。【方法】基于梨小食心虫转录组数据筛选10个候选内参基因(β-actin, 18S rRNA,β-tubulin,EF-1α,RPL13,RPL32,RSPL40,UBC7,α-tubulin和RPS20);通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定候选内参基因在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢)以及不同浓度的3种杀虫剂(阿维菌素：19.819, 72.897和179.663μg/mL;吡虫啉：17.638, 163.323和762.986μg/mL以及高效氯氟氰菊酯：33.791, 96.123和198.282μg/mL)通过玻璃管药膜法处理后成虫中的表达量;利用geNorm, NormFinder,ΔCt, BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。选择梨小食心虫细...     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

盐生植物碱蓬Actin基因片段的克隆及序列分析

目的:克隆盐生植物碱蓬(Suaeda glauca)Actin基因片段,为研究其它基因在碱蓬的表达和调控提供内参基因.方法:根据已知植物Acfin基因的保守序列设计一对简并性引物,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段,使用分子生物学软件进行序列分析.结果:获得一段大小为598bp的基因片段,编码198个氨基酸;该序列与其它Actin基因核苷酸序列的同源性均在80%以上,与氨基酸序列的同源性达93%以上.结论:克隆的基因为Actin基因片段,将其命名为SgACT,并登录在GenBank,登录号为EU429457.     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析北大核心CSCD

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。