香蕉红素氧还蛋白酵母双杂交eDNA文库的构建及鉴定

结合改良的BD SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit User Manual cDNA合成试剂盒,反转录合成带有目的接头cDNA第一链,通过LD-PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).产物经双酶切后回收,与经同样双酶切的酵母双杂交系统中pGADT7载体连接转化,并进行了鉴定.结果表明:提取的RAN的A260/A280=1.82,表明所提RNA纯度高:双链cDNA文库大于0.2 kb,且弥散较长,成瀑布条带状;根据生长菌落计数,文库含有1.2×106转化子,重组子不同插入片段在0.3～2 kb之间.表明该文库达到建库要求,为下一步进行酵母双杂交试验奠定基础.此方法用于构建cDNA文库与酵母双杂交系统相结合的研究目前尚未见过相关报道.     

抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中是否具有转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增抗增殖蛋白基因全长序列,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-PHB,制备酵母菌AH109感受态细胞,将pGBKT7-PHB转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:扩增出抗增殖蛋白基因全长序列,构建了诱饵载体pGBKT7-PHB,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明报告基因未被激活。结论:抗增殖蛋白没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

为构建鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因酵母双杂交诱饵载体,采用PCR技术扩增出DEV-NP基因,克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,以PCR检测、限制性酶切和序列测定等方法进行鉴定;然后采用PEG/LiA.法将阳性质粒pGBKT7-NP转化酵母Y2HGold,在不同营养缺失型培养基进行自激活检测,结果显示,经PCR检测和EcoR I/BamH I双酶切,可见到与预期相一致的目的片段;测序表明该片段含DEV NP基因全部序列;转化Y2HGold酵母菌后,在SD/-Trp/X-a-Gal 固体培养基上长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/X-a-GaUAbA固体培养基上未见有菌落生长.无自激活作用的诱饵载体pGBKT7NP的成功构建,为DEV NP宿主结合蛋白的筛选莫定了基础.     

香蕉束顶病毒nsp酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活验证

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA6编码的核穿梭蛋白(nuclear shuttle protein,NSP)在病毒的侵染、复制、运输中起重要作用。为了利用酵母双杂交系统研究BBTV DNA6与寄主香蕉蛋白的互作,本实验利用两对引物的PCR扩增得到BBTV -nsp片段,混合各自PCR产物进行熔化退火可得到1/4两端含有EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点序列的DNA产物,将目的片段连接到酵母双杂交系统的pGBKT7诱饵载体中,成功获得pGBKT7-nsp,并将重组质粒pGBKT7-nsp转化入Y2H Gold酵母菌株中进行毒性检测和自激活验证。结果表明,pGBKT7-nsp没有自激活活性,同时对酵母细胞也无毒性,符合酵母双杂交诱饵质粒的要求,可用于下一步的蛋白互作实验。     

日本脑炎病毒E蛋白在酵母双杂交系统中的表达及其对报告基因激活作用的检测

用日本脑炎病毒(JEV)E蛋白基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。用RT—PCR从JEV感染的鼠脑中扩增出JEV E蛋白基因片段,克隆入pUCl9质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AHl09,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。成功获得JEV E蛋白基因片段,表达的E蛋白对酵母菌AHl09无毒性,对报告基因亦无激活作用。为利用酵母双杂交GAL4系统3进行JEV细胞受体蛋白的研究奠定了基础。     

核转录因子TR3及其缺失突变体在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测TR3及其转录活性域缺失突变体在酵母双杂交系统中的转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增TR3全长序列及其缺失突变体,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-TR3和pGBKT7-TR3/Δ1～690,将pGBKT7-TR3转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:构建了包含TR3全长序列和TR3/Δ1～690序列的诱饵载体,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明β-半乳糖苷酶报告基因未被激活。结论:TR3及其转录活性域缺失突变体没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

构建用于杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)酵母双杂交试验的诱饵栽体,进行自激活及毒性验证.以含有盐藻MBP质粒为模板,经PCR扩增后连接pMD 18-T栽体,经测序鉴定正确后,EcoR Ⅰ/Nde Ⅰ双酶切获得目的基因MBP,克隆入经同样双酶切的酵母栽体pGBKT7,转化酵母菌株AH109及Y187,检测其自激活以及毒性.结果显示,成功扩增出盐藻MBP基因,重组质粒pGBKT7-MBP经酶切、测序表明序列正确,转化酵母菌株无自激活,无毒性.     

人类RhoxF1蛋白的生物信息学分析及其自激活检测

目的：生物信息学分析人类RhoxF1蛋白的氨基酸序列,构建RhoxF1酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。方法：生物信息学分析RhoxF1蛋白保守区域,比较小鼠Rhox5与人RhoxF1的氨基酸序列同源性,PCR扩增RhoxF1基因,与PMD-18-T载体连接,然后把RhoxF1克隆到pGBKT7载体中,醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-RhoxF1转入酵母菌AH109,观察pG-BKT7-RhoxF1在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果：RhoxF1蛋白保守区域有大量的DNA结合位点,与Rhox5具有30%的同源性。成功构建诱饵载体pGBKT7-RhoxF1,目的片段可在酵母AH109中表达,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。结论：探索了RhoxF1的蛋白特性,成功构建pGBKT7-RhoxF1重组质粒,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与RhoxF1相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。     

应用酵母双杂交系统筛选新基因Collectrin相关蛋白

Collectrin是在小鼠 5 6肾切除后 ,在肾小球的高滤过、高增生期分离克隆的一个新基因 .通过酵母双杂交系统从人肾脏cDNA文库中筛选与collectrin相互作用的蛋白 ,可以为该基因的功能研究提供线索 .构建collectrin的真核表达载体collectrin pGBKT7 c myc ,转化酵母菌AH10 9.Western印迹证实 ,collectrin蛋白能够在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象 .将AH10 9 collectrin pGBKT7 c myc与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,共筛选到 5个与细胞代谢有关的蛋白 ,包括鞘磷脂激活蛋白、精氨琥珀酸合成酶、氨基酸转运蛋白XAT2、NADH脱氢酶 1和金属硫蛋白 2A .由此推论 ,collectrin可能通过与细胞内某些酶类相互作用而影响细胞代谢 ,为新基因collectrin的功能研究提供了重要线索 .     

酵母双杂交中诱饵蛋白载体的构建与鉴定方法

酵母双杂交已是研究蛋白质相互作用的经典方法之一。该方法以真核生物酵母为模型,在体内研究活细胞内蛋白质的相互作用,具有高度敏感性,被很多研究者采用。综述了酵母双杂交系统中诱饵蛋白载体的构建,及其在转化酵母中的毒性、自激活性检测研究的最新进展。     

应用酵母双杂交技术寻找与GGNBP相互作用的蛋白质

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是20个世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,其不育原因是由于其胚胎期原始生殖细胞的数目低于正常。FancL(也叫Pog)的缺失是引起gcd突变小鼠的原因,FancL基因缺失后可能影响了小鼠胚胎期原始生殖细胞的增殖／存活和成年期小鼠精母细胞的减数分裂。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,GGN1和GGN2又与一种新的蛋白质GGNBP特异作用。但GGNBP蛋白的功能还不清楚。为了研究GGNBP的功能以及揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第3套酵母双杂交系统,以GGNBP为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白质基因,发现了一个主要在睾丸中表达的新的基因,其编码的蛋白质产物在酵母系统中与GGNBP特异作用。     

人为干扰对小果野芭蕉群落生物量及多样性的影响

采用标准木法和回归分析法（乔木层）研究了小果野芭蕉群落在演替吕不同的压力条件下生物量和多样性的变化,结果显示,小果野芭蕉的侵入在正常情况下对群落生物量的影响并不显著,但由于人为干扰,可以明显地降低群落生物量。人为干扰是小果野芭焦群落长期保持在一个种群数量较大,物种多样性指较低和重要值较大的状态。轮歇丢荒地小果野芭蕉的侵入和迅速发展,是群落恢复演替过程中一种正常的途径。因此保持小果野芭蕉群落不受人为干扰是使其沿正常演替途径恢复的一种可行方法。     

Synthesis of 2-(4-Hydroxyphenyl)naphthalene-1,8-dicarboxylic Anhydride,a Phytoalexin Isolated from Unripe Banana (Musa acuminata)

2-(4-Hydroxyphenyl)naphthalene-1,8-dicarboxylic anhydride, a component of the phytoalexin that has been isolated from the peel of unripe banana (Musa acuminata), was synthesized from 3-bromoacenaphthene.     

西双版纳野芭蕉先锋植物群落的结构特征及其演替动态

对西双版纳勐腊县麻木树地区的热带雨林刀耕火种撂荒后形成的不同演替阶段的野芭蕉先锋植物群落进行了植物种类组成、区系成分、结构特征及种群数量与年龄结构的动态变化分析。结果表明 :在 10 0 0m2 的样地上 ,随着群落的发展和演替的进行 ,群落的科、属、种组成日趋复杂 ,从侵入阶段的 17科 2 7属 30种 ,上升到定居阶段的5 0科 74属 98种 ,至扩散阶段已达 5 5科 87属 113种。 3个不同林龄阶段的群落区系组成可分为 9种类型 ,均以热带区系成分为主 ,占 90 %左右。随着群落的发展 ,泛热带分布、热带亚洲 (印度—马来西亚 )分布所占的比例随林龄逐渐增大 ,而旧世界热带分布及东亚至北美洲间断分布所占的比例在逐渐减少。群落的层次结构由简单趋于复杂 ,野芭蕉的种群数量急剧增长 ,各龄级的个体分布逐渐增多 ,群落正向着湿润性的热带森林方向发展。     

神经元蛋白3.1结合蛋白酵母双杂交筛选体系的建立

神经元蛋白3.1(P311)是肺泡发育的上游调节因子。以pEGFP-P311重组质粒为模板,利用PCR方法扩增P311基因编码序列。通过Nde I和BamH I位点插入诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-P311。重组体转化酵母菌AH109进行自激活和毒性检测,结果 DNA-BD-P311融合蛋白无单独激活报告基因作用,对酵母菌亦无毒性。以出生11 d小鼠肺组织为材料,提取总RNA。逆转录产生单链cDNA,通过长距离PCR进行扩增。扩增产物ds cDNA电泳后可见大小为0.2～3.0 kb间的弥散状分布条带,说明文库cDNA可满足筛选要求。诱饵载体pGBKT7-P311的构建及相应小鼠肺组织cDNA文库的建立,为进一步利用酵母双杂交技术探讨P311功能奠定了基础。     

酵母双杂交筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白

同源染色体联会时形成的联会复合体(Synaptonemal complex, SC)是由减数分裂前期Ⅰ多种蛋白质聚集而成的超级复合结构。生殖细胞特异性的核蛋白C(2)M(Crossover suppressor on 2 of Manheim)在染色体上高度聚集可以诱导SC的形成。本文采用酵母双杂交方法,利用C(2)M的诱饵表达载体筛选果蝇cDNA文库,共发现40个可能与C(2)M相互作用的蛋白,包括多种DNA及组蛋白结合蛋白、ATPase、转录调节因子。从筛选的结果中,选取wech和Psf1基因构建了转基因果蝇,并在生殖细胞中进行了基因沉默,结果显示联会复合体的消失受到延迟。上述结果表明Wech和Psf1蛋白可能与C(2)M形成复合物,共同参与联会复合体的形成或其稳定性的维持。     

Using yeast two-hybrid system to detect interactions of ATP synthase subunits fromSpinacia oleracea

Subunit interactions among the chloroplast ATP synthase subunits were studied using the yeast two-hybrid system. Various pairwise combinations of genes encoding α, β, γ, δ and ε subunits ofSpinach ATP synthase fused to the binding domain or activation domain of GAL4 DNA were introduced into yeast and then expression of a reporter gene encoding β-galactosidase was detected. Of all the combinations, that of γ and ε subunit genes showed the highest level of reporter gene expression, while those of α and β, a and ε, β and ε and β and δ induced stable and significant reporter gene expression. The combination of δ and ε as well as that of δ and γ induced weak and unstable reporter gene expression. However, combinations of α and γ, β and γ and α and δ did not induce reporter gene expression. These results suggested that specific and strong interactions between γ and ε, α and β, α and ε, β and ε and β and δ subunits, and weak and transient interactions between δ and ε and δ and γ subunits occurred in the yeast cell in the two-hybrid system. These results give a new look into the structural change of ATP synthase during catalysis.     

酵母双杂交筛选与GsCBRLK相互作用的蛋白质

GsCBRLK(calcium/calmodulin-binding receptor-like kinase from Glycine soja)在ABA及盐胁迫诱导的钙离子信号通路中起到关键的调节作用。为深入研究GsCBRLK蛋白的作用机制, 文章采用膜酵母双杂交系统, 以GsCBRLK为诱饵蛋白, 筛选与其相互作用的蛋白质。通过构建野生大豆盐胁迫条件下的cDNA文库、膜酵母双杂交系统筛选、复筛、回转验证、生物信息学分析以及酵母体内互作验证等手段, 最终获得2个(SNARE 和 14-3-3 蛋白)与GsCBRLK诱饵蛋白相互作用的蛋白质。     

Using yeast two-hybrid system to detect interactions of ATP synthase subunits from Spinacia oleracea

Subunit interactions among the chloroplast ATP synthase subunits were studied using the yeast two-hybrid system. Various pairwise combinations of genes encoding a, p, y, 8 and e subunits of Spinach ATP synthase fused to the binding domain or activation domain of GAL4 DNA were introduced into yeast and then expression of a reporter gene encoding p-galactosidase was detected. Of all the combinations, that of y and e subunit genes showed the highest level of reporter gene expression, while those of a and p, a and e, p and e and p and 8 induced stable and significant reporter gene expression. The combination of 8 and e as well as that of 8 and y induced weak and unstable reporter gene expression. However, combinations of a and y, p and y and a and 8 did not induce reporter gene expression. These results suggested that specific and strong interactions between y and e, a and p, a and e, p and e and p and 8 subunits, and weak and transient interactions between 8 and e and 8 and y subunits occurred in the yeast     

Screening of proteins that interact with human thrombopoietin receptor c-Mpl using yeast two-hybrid system

Thrombopoietin (TPO) is the major cytokine involved in platelet production and exerts its effects via the receptor c-Mpl. The yeast two-hybrid system has been used to screen the proteins interacting with c-Mpl. First, the cDNA fragment of c-Mpl intracellular domain was cloned into two-hybrid vector pAS2, and the resulting plasmid is designated as pASMM. Then a human placenta cDNA library was screened using the pASMM as a target plasmid. Seven positive clones were isolated from 150 000 independent transformants. Sequence analysis of one of the positive clones demonstrates that a part of coding sequence of vimentin from 611 bp to 3′ end and flanking non-translation region was obtained. Therefore, there is an interaction between vimentin and TPO receptor. The results suggest that cytoskeletal protein may play an important role in TPO signal transduction pathway.