利用蛋白质组学手段鉴定新型贻贝足丝蛋白

贻贝通过足腺分泌特有的足丝并以此粘附于水下各种基质表面.贻贝足丝中富含各种粘附蛋白,其优异的水下粘附性能使其成为开发新型生物粘合剂的候选分子.厚壳贻贝足丝粘附能力强,本文采用尿素及盐酸胍抽提结合二维双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,分别对厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘的蛋白质进行分离及染色;采用串联质谱技术结合常规搜库和表达序列标签（EST) 数据库搜索,对分离获得的蛋白质点进行鉴定,从中获得了mfp-3、mfp-6、胶原蛋白以及3种未曾报道过的新型贻贝足丝蛋白成分.上述研究为深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性、探讨其粘附机理以及从中筛选具有应用前景的贻贝足丝蛋白奠定了基础.     

基于illumina测序的厚壳贻贝足组织转录组研究

贻贝足丝是贻贝足组织分泌的足丝蛋白形成的非细胞组织,具有在水环境下的极强粘附性能,是当前生物粘附剂及抗腐蚀材料的研发热点．为进一步了解贻贝足丝蛋白的分子多样性特征,采用新一代Illumina高通量测序平台对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)足组织进行转录组测序,首次构建了厚壳贻贝足组织的转录组数据库．共计获得7 199 799 840 nt的碱基数据经过序列拼接和组装,获得88 825条unigene．对上述unigene开展了序列注释,共计37 007条unigene获得注释．在此基础上,经序列检索和比对,从中筛选出与目前已知的11种足丝蛋白同源的56条unigene序列并进行分析．结果表明,厚壳贻贝足丝蛋白具有明显的氨基酸偏好性,部分足丝蛋白具有重复序列,且厚壳贻贝足丝蛋白与其他种类的贻贝足丝蛋白具有较高的序列相似性．上述结果为后续贻贝足丝蛋白的批量鉴定以及在此基础上的贻贝足丝形成、固化以及粘附机制相关研究奠定了基础．     

厚壳贻贝Mytilus coruscus足丝盘及足丝的多巴分析

多巴(3,4-1-dihydroxyphenylalanine,DOPA)是贻贝足丝粘附蛋白中的一种特殊的氨基酸,由酪氨酸经羟化后生成,与贻贝足丝粘附蛋白的强粘附性能具有直接联系.目前,已鉴定的多种贻贝足丝蛋白序列中均发现有不同含量的DOPA存在.蛋白中DOPA的定量检测对于了解DOPA在蛋白粘附中的作用以及粘附蛋白的...     

厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的初步鉴定(英文)

足丝蛋白是贻贝科(Mytilidae)所特有一种在水环境中也能表现出强黏附功能的蛋白,也是目前开发新型生物黏附剂的主要候选分子。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部沿海,是我国具有重要经济价值的贻贝,其足丝粗硬,黏附力强,关于厚壳贻贝的足丝蛋白的研究目前尚未见报道。通过醋酸抽提结合反相高效液相色谱分离,从厚壳贻贝足丝盘中分离纯化到数种低分子量足丝蛋白,经质谱鉴定和氨基酸序列测定,其中三种足丝蛋白(分子量6 kD左右)属于贻贝足丝蛋白-3(mytilus foot protein-3,mfp-3)家族,且序列中富含DOPA,另有三种足丝蛋白为未知新型足丝蛋白。石英晶体微天平分析表明,厚壳贻贝低分子量足丝蛋白在金表面有较强的吸附能力,这与其黏附功能是直接相关的。以上工作为深入了解厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的分子多样性以及黏附机制奠定了基础。     

厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3的重组表达及黏附功能分析

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3（mussel foot protein-3, mfp-3）是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3的cDNA序列为目的基因,用PCR法扩增Mfp-3基因,并成功构建含有多聚组氨酸标签的重组mfp-3原核表达载体pET-21a/ Mfp-3.经IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达出重组蛋白,利用亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化,获得分子量为9.18 kD的重组蛋白.经酪氨酸酶催化、玻璃包被和石英晶体微天平（quartz crystal microbalance,QCM）分析.结果表明,重组厚壳贻贝mfp-3蛋白经酪氨酸酶催化后,L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴,L-3,4- dihydroxyphenylalanine, DOPA) 含量较高并且具有较好的黏附性能.上述研究为开发以mfp-3黏附蛋白为来源的生物粘合剂奠定了良好的基础.     

利用质谱技术结合EST库搜索鉴定厚壳贻贝新型足丝蛋白

贻贝利用足丝粘附于水下各种基质表面.作为一种具有优异粘附性能的生物材料,贻贝足丝蛋白在新型水下粘附剂及表面保护涂层的研制与开发中具有重要的仿生学意义.目前,已报道的贻贝足丝蛋白分子达11种,但是仍然有更多的足丝蛋白分子不为人知.为进一步探讨贻贝足丝蛋白的分子多样性,并从中筛选具有特殊生物学功能的足丝蛋白分子,本文采用鸟枪法-液相色谱-质谱/质谱技术（shotgun-LC-MS/MS）对厚壳贻贝足丝蛋白进行了蛋白质组学分析.将厚壳贻贝足丝分为足丝纤维和足丝盘两部分,每一部分均采用醋酸-尿素溶液,以及醋酸-盐酸胍溶液进行蛋白质抽提;抽提后的足丝蛋白经胰蛋白酶酶解,利用线性离子阱四级杆质谱（LTQ）进行鸟枪法质谱分析.二级质谱图（MS/MS）用以搜索公共数据库中的贻贝表达序列标签（expressed sequence tag,EST）数据库.采用上述方法,获得14种贻贝新型足丝蛋白的高可信度结果及其所匹配的部分或全长cDNA序列;经结构域分析,发现上述新型贻贝足丝蛋白分子的序列中多数包含各种类型的结构域,包括胶原蛋白结构域、C1Q结构域、C1Q结合结构域、微管蛋白辅助折叠结构域、蛋白酶拮抗结构域、VWA结构域、几丁质酶结构域等.在此基础上,对上述新型足丝蛋白在贻贝足丝形成以及粘附方面的功能进行了推测.上述结果对进一步了解贻贝足丝的分子组成以及粘附机理奠定了基础.     

贻贝的黏着机制

贻贝通过足丝（byssus）分泌的贻贝黏着蛋白质（mussel adhesive protein,MAP）能附着在海水中的任何有机物和无机物表面,目前认为贻贝黏着蛋白质中含高浓度特殊的氨基酸DOPA（3,4-二羟基苯丙氨酸）在贻贝黏附过程中扮演重要的角色。DOPA能直接与金属氧化物通过有机金属络合反应形成稳定的络合物,也能在氧化后与其同一多肽链上或不同多肽链上的其他残基形成稳定的交联结构,进而牢固黏附于物体表面。贻贝黏着蛋白质具有黏合范围广、速度快、耐腐蚀、强度高和生物亲和性良好等优点,被认为是极好的广谱生物胶黏剂而应用于医学和生物工程等领域。     

皱纹盘鲍外套膜、鳃和足粘液细胞的类型与分布

以阿新兰和过碘酸雪夫氏反应(AB．PAS)染色法显微观察皱纹盘鲍(1taliotis discus hannai)的外套膜、鳃和足的粘液细胞。根据所显示颜色的不同,可将粘液细胞分为Ⅰ～Ⅳ4种类型：分别呈红色、蓝色、紫红色和蓝紫色。外套触手和外套膜上皮的粘液细胞以Ⅱ型为主,Ⅳ型较少,密度不均,多为近圆形细胞,大型和小型细胞均有分布。鳃轴和鳃叶上皮的粘液细胞密度较大,以Ⅱ型和Ⅰ型为主,Ⅲ型和Ⅳ型较少,形态有杯形、近圆形或棒状等,多为中型及小型细胞。足的上皮粘液细胞较少,均为Ⅱ型,但局部上皮的细胞含有许多棕色颗粒。     

基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂的制备及性能研究

目的:以实验室制得的聚苹果酸(PMLA)为高分子骨架,通过酰胺化反应将多巴胺(DA)分子连接到聚苹果酸,制得既具有良好粘合性能,又有优异生物相容性的贻贝仿生粘合剂。方法:L-天冬氨酸通过内酯开环聚合法合成高分子化合物聚苹果酸,将PMLA与DA加EDC/NHS反应得到粘合剂PMLA-DA,傅里叶变换红外光谱、核磁氢谱、紫外可见光光谱等对其进行结构表征,标准曲线法测多巴胺取代度,采用搭接剪切测试法评估粘合剂对不锈钢、玻璃、猪皮三种材质的粘合强度,MTT法检测贻贝仿生粘合剂的细胞毒性,通过降解试验验证PMLA-DA的降解性能。结果:测得PMLA-DA中多巴胺的取代度能达到21.3%,搭接剪切试验测得粘合剂对猪皮的粘合强度为22.68 kPa,高于目前市场上常用的生物医用粘合剂纤维蛋白胶15.38 kPa的粘合强度,PMLA-DA对不锈钢与玻璃亦有很好的粘合性能。细胞毒性研究和体外降解试验显示PMLA-DA无细胞毒性,降解性能良好。结论:通过聚苹果酸与多巴胺反应制得贻贝仿生粘合剂PMLA-DA,该粘合剂对多种材质均具有良好的粘合力;无细胞毒性,降解性能良好,对皮肤组织的粘合强度优于目前商用的生物粘合剂纤维蛋白胶。无论是对无机材料间的粘接,或者是医学领域的伤口粘合,均具有良好的应用前景。     

短蛸外套膜和足粘液细胞的类型及分布

采用阿新兰与过碘酸雪夫氏反应(AB-PAS)染色法对短蛸(Octopusocellatus)外套膜和足各部位粘液细胞进行分类及分析。将粘液细胞分为Ⅰ~Ⅳ4种类型:分别呈红色、蓝色、紫红色和蓝紫色。胴体部背面和腹面的外套膜外表皮均有4种粘液细胞,以Ⅲ型和Ⅳ型粘液细胞为主,背面粘液细胞密度较小,腹面的密度较大。腕上皮皱褶处粘液细胞密度较大,其他大部分区域粘液细胞密度较小,以Ⅱ型为主,另有少量Ⅲ型和Ⅳ型粘液细胞;吸盘外上皮含有大量的粘液细胞,也以Ⅱ型为主。漏斗内外上皮粘液细胞密度较大,基部以Ⅱ型为主,其他部位则以Ⅲ型为主。通过对各部位粘液细胞的分类和比较,可以看出粘液细胞的分布和类型与其所在部位执行的功能有密切的联系。