大肠杆菌ubiA基因的克隆及序列测定

以E．coli JM83染色体DNA为模板PCR扩增ubiA的结构基因,将PCR产物克隆于pUCm-TVector,对PCR产物进行测序鉴定。与已发表的大肠杆菌ubiA基因序列比较,同源性达99％。     

大肠杆菌ubiA基因的克隆及序列测定

以E.coli JM83染色体DNA为模板PCR扩增ubiA的结构基因,将PCR产物克隆于pUCm-T Vector,对PCR产物进行测序鉴定。与已发表的大肠杆菌ubiA基因序列比较,同源性达99％。     

基因组改组技术及其在微生物育种中的应用研究进展

Genome shuffling(基因组改组)技术是借助递归式原生质体融合策略对微生物基因组进行遗传改良的一种新兴微生物育种方法。自2002年首次被用来培育tylosin高产菌株以来,目前已为育种工作者广泛采用。对Genome shuffling技术的原理及最近的应用研究进展进行了综述,探讨了其局限性,并展望了其发展的趋势。     

阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用

阳离子脂质体已经成为基因转移使用最广泛的载体之一。本文从阳离子脂质体的理化特性、质粒／阳性子脂质复合体与生物大分子的相互作用、质粒／脂质复合体的基因转移机制等方面,对阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用进行了综述。     

DNA改组技术在酶工程中的应用

DNA改组技术是一种应用最广泛且简单有效的分子定向进化方法.它是一种高通量的随机突变筛选技术,可以对目的基因进行多次重组和选择,得到性质优良的突变文库.介绍了DNA改组技术的原理及其在酶工程中的应用.     

拟南芥K+转运蛋白AtKup1基因的DNA改组

采用同源重组法制备钾离子转运蛋白基因TRKI和TRK2缺失的酿酒酵母钾营养缺陷型。通过RNA反转录PCR方法从拟南芥幼根扩增获得片段长度为2 139bp的AtKup1基因,以此片段为膜板,采用DNA重排技术,经DNase I降解,Primerless PCR和Primer PCR建立AtKup1基因突变库。将突变库和未经DNA重排处理的AtKup1基因分别构建酵母穿梭载体,并导入K 转运蛋白基因TRK1和TRK2缺失的酿酒酵母中,分别在低钾(5．0mmoL／L KC1)不合色氨酸的培养基上筛选转化子,从突变基因库酵母转化子中获得2株长势明显优于AtKup1基因转化子的突变基因转化菌株,菌株质粒上的突变AtKup1基因核苷酸测序结果表明突变基因AtKup1发生了2个碱基的置换,造成了2个氨基酸的改变。转化烟草烟叶化学成分分析证实突变基因的吸钾活性显著提高。     

DNA改组技术发展与应用

DNA改组技术是目前蛋白质、酶和单克隆抗体等体外定向进化的高效方法。综述了DNA改组技术的发展及其应用 ,在提高酶活性、蛋白质产量和改善蛋白质 (酶 )的性能等方面具有广泛的应用前景。     

基因改造Rhodobacter sphaeroides提高

[目的]通过敲除类球红细菌2.4.1基因组中八氢番茄素合成酶基因crtB,让异戊二烯前体更多流向辅酶Q10的合成.引入大肠杆菌编码的分支酸裂解酶基因ubiC和4-羟苯甲酸转移酶基因ubiA,提高4-羟苯甲酸的合成和与聚异戊二烯的连接,从而提高类球红细菌的辅酶Q10产量.[方法]以自杀型质粒pSUP202为载体,构建包含crtB基因上游2.5 kb片段,壮观霉素抗性基因,ubiC、ubiA基因和crtB基因下游2.5 kb片段的基因置换质粒,利用结合转移方法转入类球红细菌2.4.1中,利用抗性机制筛选双交换突变株,RT-PCR方法检测引入的ubiC和ubiA基因转录.用HPLC方法测定出发菌株和基因改造菌株的辅酶Q10产量.[结果]成功构建出基因置换质粒,筛选出发生基因置换的突变株,RT-PCR证实了外源基因的转录,并且突变株辅酶Q10的产量比出发菌株提高40％.[结论]大肠杆菌的ubiC和ubiA基因能够利用自身启动子在类球红细菌中表达,利用基因改造的方法能成功提高类球红细菌的辅酶Q10产量.     

利用DNA改组技术改造aacC1基因启动子活性的研究

从表达质粒pYPX251(GenBank 登陆号：AY178046)中获得aacC1基因启动子,采用DNA改组（DNA shuffling）技术在体外获得突变体。以lacZ作为报告基因,筛选获得活性明显改变的启动子。经过验证,对其中活性变化明显的7个启动子用邻硝基苯基β半乳糖苷(ONPG)作为底物进行表达活性测定。结果表明,获得的强启动子比原来的提高了3～8倍,而弱启动子则活性下降明显,其中3个几乎无活性。进一步对这7个启动子进行了序列分析。     

基因检测技术 探针在诊断中的应用

在过去几十年来,世界上用分子水平分析的方法来研究人的基因失调已有许多报告,增加了很多新的知识,这些知识是由于生化的重组基因技术而来,用在单独的分析特异的基因、基因产物以及核酸结构分析编码,基因表达的规律,从而用以检测某些疾病,例如早期妊娠时测定血清或羊水中的基因紊乱,可以及时治疗或预防。     

Molecular breeding of genes, pathways and genomes by DNA shuffling

Existing methods for optimization of sequences by random mutagenesis generate libraries with a small number of mostly deleterious mutations, resulting in libraries containing a large fraction of non-functional clones that explore only a small part of squence space. Large numbers of clones need to be screened to find the rare mutants with improvements. Library display formats are useful to screen very large libraries but impose screening limitations that limit the value of this approach for most commercial applications. By contrast, in both classical breeding and in DNA shuffling, natural diversity is permutated by homologous recombination, generating libraries of very high quality, from which improved clones can be identified with a small number of complex screens. Given that this small number of screens can be performed under the conditions of actual use of the product, commercially relevant improvements can be reliably obtained.     

用基因组重排技术选育赖氨酸高产菌株

摘要：【目的】以北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）1为研究对象,选育赖氨酸高产菌株,并探索赖氨酸产生菌基因组重排育种的基本规律。【方法】利用基因组重排技术选育赖氨酸高产菌株。【结果】通过四轮基因组重排成功选育出了5株遗传稳定的高产赖氨酸菌株,其中1株重排菌株赖氨酸产量达到16.95 g/dL,比原始菌株Corynebacterium pekinense 1赖氨酸产量提高了37.14%,比亲本菌株赖氨酸产量提高了17.46％~31.19%。【结论】首次采用基因组重排技术改良赖氨酸产生菌,成功选育出了5株产量较稳定的高产赖氨酸菌株,具有潜在的应用价值。     

拟南芥K+转运蛋白AtKup1基因的DNA改组

采用同源重组法制备钾离子转运蛋白TRK1和TRK2缺失的酿酒酵母钾营养缺陷型,通过RNA 反转录PCR方法从拟南芥幼根扩增获得片段长度为2139bp 的Atkup1基因,以此片段为模板,采用DNA 改组技术,经Dnase I降解,Primerless PCR , PrimerPCR,建立Atkup1 基因突变库。将突变库和未经DNA 重排处理的Atkup1基因分别构建酵母穿梭载体导入K+转运蛋白基因TRK1和TRK2缺失的酿酒酵母中,分别在低钾(5.0mM KCl)不含色氨酸的培养基上筛选转化子, 突变基因库酵母转化子中获得2株长势明显好于Atkup1 基因转化子的突变基因转化菌株,菌株质粒上的突变Atkup1基因核苷酸测序结果发现突变基因Atkup1发生2个碱基的置换,造成2个氨基酸的改变,转化烟草烟叶化学成分分析证实突变基因的吸钾活性显著提高。     

利用DNA Shuffling技术构建重组PRRSV ORF5基因

通过DNA shuffling技术对PRRSV ORF5基因进行改组,研究其对异源毒株交叉中和能力。将获得的嵌合基因△2ORF5与载体pET-32a连接,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21中,经诱导表达获得约42 kDa重组蛋白。将纯化的重组△2ORF5蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,Western blotting试验表明其与4株亲本毒株重组ORF5蛋白具有良好的反应性。病毒感染抑制试验结果表明,多克隆抗体对4株亲本毒株具有较高的抑制率(53%)。研究结果为研制新型PRRSV疫苗奠定了基础。     

基因组重排技术在酵母菌育种中的应用

基因组重排(genome shuffling)技术是在传统诱变育种的基础上与细胞原生质体融合技术相结合一种新兴微生物菌种改良手段,由于该技术高效的正向突变效率和频率,近年来被广泛应用于酵母菌种的选育和改良。本文主要对基因组重排技术在酵母菌育种中的应用进行了综述。     

Tup1突变对转录抑制局部网络中基因表达的非线性影响

研究基因网络的非线性行为特征是研制基因网络技术的基础。Tup1基因是酵母中作用最为广泛的转录抑制因子之一,利用酵母生物信息学数据库中蛋白相互作用关系,构建一个以Tup1为中心,4个层次741个基因的局部基因网络。统计分析六张Tup1不同突变的基因表达芯片数据,将局部基因网络中的全部基因按照3个网络特征进行统计分析：必需、非必需基因、网络层次和网络节点,并研究这些特征与基因表达之间的关系。初步发现基因表达变化的强度与节点数目成一定的反比关系,必需基因的平均变化程度较非必需基因为低,且由Tup1突变引发的其他基因的表达变化在以Tup1为中心的局部基因网络中近层次网络变化程度较大,远层次网络变化程度较低。     

Population dynamics and gene transfer in genetically modified bacteria in a model microcosm

The horizontal transfer and effects on host fitness of a neutral gene cassette inserted into three different genomic loci of a plant-colonizing pseudomonad was assessed in a model ecosystem. The KX reporter cassette (kanamycin resistance, aph, and catechol 2, 3, dioxygenase, xylE) was introduced on the disarmed transposon mini-Tn5 into: (I) the chromosome of a spontaneous rifampicin resistant mutant Pseudomonas fluorescens SBW25R; (II) the chromosome of SBW25R in the presence of a naturally occurring lysogenic-phage (phage Phi101); and (III) a naturally occurring plasmid pQBR11 (330 kbp, tra+, Hgr) introduced into SBW25R. These bacteria were applied to Stellaria media (chickweed) plants as seed dressings [c. 5 x 104 colony-forming units (cfu)/seed] and the seedlings planted in 16 microcosm chambers containing model plant and animal communities. Gene transfer to pseudomonads in the phyllosphere and rhizosphere was found only in the plasmid treatment (III). Bacteria in the phage treatment (II) initially declined in density and free phage was detected, but populations partly recovered as the plants matured. Surprisingly, bacteria in the chromosome insertion treatment (I) consistently achieved higher population densities than the unmanipulated control and other treatments. Plasmids were acquired from indigenous bacterial populations in the control and chromosome insertion treatments. Plasmid acquisition, plasmid transfer from inocula and selection for plasmid carrying inocula coincided with plant maturation.