DNA损伤检查点蛋白调节子1片段的表达纯化及抗体制备

目的：原核表达、纯化DNA损伤检查点蛋白调节子1（MDC1）片段,并制备其多克隆抗体。方法：设计特异引物,通过RT-PCR扩增编码MDC1 N端194个氨基酸残基的基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果：原核表达并纯化了MDC1 N端片段,并获得了抗MDC1的多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹显示该抗血清能特异识别原核及真核细胞表达的MDC1。结论：MDC1 N端片段能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MDC1在Fhit特异信号通路中的作用奠定了基础。     

小分子泛素相关修饰物SUMO及其融合表达

小分子泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一类具有高度保守序列的低分子量蛋白.在蛋白质的融合表达中,SUMO作为融合标签得到了广泛应用.与其他传统融合标签如谷胱甘肽-S-转移酶、二硫键形成蛋白A、硫氧还蛋白等相比,SUMO具有防止蛋白降解、促进蛋白折叠、能被SUMO蛋白酶专一性识别切割并在目的蛋白上不会留下氨基酸残基等优点.本文综述SUMO融合蛋白及其配套的SUMO蛋白酶在融合表达中的优势和应用.     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a（＋）内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1：2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a（＋）-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

LINE-1编码蛋白L1-ORF1的原核表达纯化和多克隆抗体制备

目的: 制备具有肿瘤组织特异性表达的L1-ORF1蛋白多克隆抗体并进行初步应用研究。方法:采取基因工程表达方法制备L1-ORF1蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价,Western blot和细胞免疫荧光方法检测抗体特异性,免疫检测验证其识别肿瘤细胞内L1-ORF1蛋白的特异性。结果:制备的抗L1-ORF1蛋白多克隆抗体具有很高的敏感性与特异性,免疫学检测表明该抗体不仅能检测出正常细胞中瞬时表达的L1-ORF1蛋白,而且可检测出肿瘤细胞中天然表达的L1-ORF1蛋白。结论:制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性,为以后该抗体的进一步应用奠定了基础。     

D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及多克隆抗体的制备

为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂,需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。从菠菜中提取总RNA,逆转录合成cDNA,采用PCR扩增了CtpA的基因,连接至表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达,通过降低IPTG和诱导温度获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE和Western blotting结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物,采用高效液相色谱法测定了其水解活性,结果表明活性可达1.10nmol/(mg·min),为文献报道数据的15倍。纯化后的CtpA蛋白免疫日本的长耳大白兔制备多克隆抗体,ELISA法测定其血清抗体的效价高达1:100000。该结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。     

GST/MKRN1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达GST/MKRN1融合蛋白,亲和层析分离纯化目的蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:MKRN1cDNA全长1449bp,编码482个氨基酸残基。将其基因片段克隆到pGEX-4T-1载体上,获得pGEX-4T-1-MKRN1原核表达重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达,经谷胱甘肽Sepharose4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到pGEX-4T-1-MKRN1多克隆抗体。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可达到1∶256000。通过Western免疫印迹及免疫细胞荧光分析,自制的多克隆抗体能特异地与MKRN1蛋白相互作用,可用于免疫细胞化学分析。结论:制备了效价和特异性良好的抗MKRN1多克隆抗体,经实验验证获得的免疫血清能够满足针对MKRN1的Western免疫印迹和细胞免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究MKRN1表达的组织分布、细胞内定位及与端粒酶催化亚基(hTERT)之间相互作用的生物学意义提供了有用的实验工具。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a(+) 中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1.将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达.该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清.以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上.以Western blot 检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础.     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a( )中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1。将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达。该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清。以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上。以Westernblot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

诺如病毒NV衣壳蛋白VP1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 获得纯化的诺如病毒（NV）衣壳蛋白VP1,免疫动物制备多克隆抗体。方法 提取粪便样品中诺如病毒RNA,逆转录得到cDNA文库,通过PCR扩增获取VP1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中诱导表达重组VP1蛋白。使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠‒聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝法（BSA）对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的VP1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价、Western blot检测抗体特异性。结果 成功地构建出重组表达载体VP1-pET28a,并将其在大肠埃希菌BL21（DE3）中稳定地表达诱导重组蛋白。ELISA测其多抗血清的平均效价为1∶200000,Western blot检测抗体在原核和真核特异性很高。结论 本实验成功地利用原核表达系统表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,为进一步研究诺如病毒的诊断和疫苗开发提供了条件。     

小鼠frataxin抗体的制备及应用

弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia,FRDA)是一种常染色体隐性遗传性疾病,由frataxin(FXN)第一个内含子中GAA重复扩增导致其表达量减少所致。FXN是一种线粒体蛋白,可以调节细胞中铁的代谢,参与铁硫簇和血红素的合成,去除氧化应激等。前期研究发现FRDA病人受累组织有特异性表达的FXN亚型蛋白。为了检测小鼠不同组织中Fxn亚型蛋白的表达,首先要获得具有高度特异性和灵敏性的小鼠Fxn抗体。利用PCR技术扩增小鼠Fxn基因,通过酶切、连接、转化等常规分子克隆方法构建重组原核表达质粒pET24(+)-mFxn,经转化大肠杆菌BL21(DE3),表达可溶性含有his6标记的融合蛋白。该蛋白不含Fxn氨基端77个氨基酸的信号肽,含有130个氨基酸,理论分子量为14.38 kDa。表达的蛋白经Ni-NTA柱和连续梯度离心纯化,获得目的蛋白作为抗原;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用硫酸铵沉淀初步纯化得到多克隆抗体。经Western blotting和免疫荧光分析测试,所获得的抗体能够特异性识别细胞内源Fxn,也可应用于组织的免疫沉淀和免疫荧光。这是首次报道利用鼠源Fxn作为免疫原制备的具有高度特异性和灵敏性的Fxn抗体,为深入研究小鼠frataxin亚型蛋白的存在和功能奠定了基础。     

PHD finger protein 8蛋白多克隆抗体的制备、纯化与检测

PHD finger8(PHF8)蛋白是最新发现的一种带有PHD结构域和Jmjc结构域的蛋白。现有研究表明其可能在基因转录、组蛋白去甲基化等方面发挥重要作用。为研究其功能,本研究构建原核表达载体pET41b-PHF8(aa886-936),在大肠杆菌Escherichia coli BL21中诱导表达带有GST标签的PHF8(aa886-936)亲水片段融合蛋白,并纯化该片段作为抗原免疫家兔,再以CNBr活化Sepharose4B微珠纯化抗血清制备PHF8特异性多克隆抗体。Western blotting以及免疫荧光检测表明该抗体具有很好的特异性,同时免疫荧光染色的结果也表明PHF8蛋白定位于细胞核。     

GST-Ccd1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：利用大肠杆菌DH5α表达GST—Ccd1融合蛋白,并用亲和层析分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法：利用本室构建好的pGEX-5X-1-Ccd1-N原核表达重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达。经谷胱甘肽Sepharose 4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到Ccd1的兔源多克隆抗体。结果：ELISA结果显示血清抗体效价可以达到1∶40 000。免疫组化分析表明自制的抗体能特异性与Ccd1蛋白相互作用,可以用于实验分析。结论：制备了效价高特异性良好的抗Ccd1多克隆抗体,经实验验证获得的抗体能够满足针对Ccd1的免疫印迹和免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究Ccd1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有用的实验工具。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

MUC1粘蛋白的分离纯化及其抗体的制备

经高速离心从正常人乳中获得人乳汁颗粒膜(HMFGM),产量约0．4g／L。经进一步破碎、脱脂及sepharose CL-4B柱纯化,获得含MUC1粘蛋白的组分,并经SDS—PAGE、Western—blot及ELISA鉴定后,免疫家兔制备多抗。结果表明,进一步凝胶过滤获得MUC1粘蛋白,行SDS—PAGE后经希夫试剂和考马斯亮蓝染色呈单一条带,表观相对分子质量大干205000。Western—blot及ELISA结果表明可与MUC1特异性抗体结合。制备获得的多抗经ELISA测定效价为1：64000～1：128000。表明建立了MUC1粘蛋白的纯化方法,获得的MUC1粘蛋白及其抗体可进一步用于MUC1检测及其功能的研究。     

小麦种子过氧化物酶WP1 基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

WP1是小麦种子中最主要的阳离子过氧化物酶,该酶不仅参与种子的发育过程,而且影响面粉的加工品质。首先构建了WP1基因原核表达载体pET28a-WP1,并将其转化到T7 Expression大肠杆菌菌株中诱导表达。His-tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化,获得纯度大于98％的重组蛋白。重组WP1经尿素梯度透析复性溶解后免疫新西兰大白兔,最终获得WP1多克隆抗体。ELISA分析结果显示制备的WP1兔抗血清的效价大于1∶625 000;Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对WP1具有很好的专一性。     

单增李斯特菌InternalinA的表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆表达单增李斯特菌膜表面蛋白InternalinA(InlA),经免疫家兔获得多克隆抗体,为建立其免疫磁珠富集快速检测方法奠定基础。【方法】利用生物软件设计单增李斯特菌inlA基因的引物,通过PCR扩增出inlA基因,并将其克隆至pET28a()原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。免疫家兔,制备其多克隆抗体。间接ELISA检测多抗的效价及交叉性,免疫荧光分析多抗与单增李斯特菌菌体结合的特异性。【结果】成功表达了InlA蛋白,融合表达产物分子量约为92 kD,质谱鉴定其为InlA蛋白;免疫家兔获得的抗血清效价为1:100 000,除与金黄色葡萄球菌约20%的交叉外,与副溶血弧菌等其它病源菌均无交叉;免疫荧光证实该多抗特异性结合于单增李斯特菌膜表面,与同种属的威尔斯李斯特菌不结合。【结论】成功制备了单增李斯特菌特异性的兔多克隆抗体,为单增李斯特菌免疫磁珠富集快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗A型流感病毒聚合酶碱性蛋白1多克隆抗体的制备和鉴定

流感病毒属于正黏病毒科,为有包膜包裹的单股负链RNA病毒。它的8个基因片段编码至少16种病毒蛋白,其中3个蛋白组成流感病毒的聚合酶复合体。流感病毒聚合酶碱性蛋白1(PB1)是该复合体的组分之一,在病毒的转录、复制及重配中发挥重要的作用。为研究其功能,构建His-PB1(aa 550–755)融合蛋白原核表达质粒,IPTG诱导融合蛋白表达,通过镍柱亲和将其纯化,然后作为抗原免疫家兔。对抗血清进行间接ELISA检测,表明抗体效价可达1∶100 000。兔源PB1蛋白抗血清经亲和纯化后,用于免疫印迹检测流感病毒WSN毒株PB1蛋白以及外源转染的FLAG-PB1蛋白,结果表明该PB1抗体具有良好的特异性,同时也能特异性识别其他亚型的A型流感病毒的PB1蛋白,为进一步研究流感病毒PB1蛋白的功能奠定了基础。     

人类重组PIF1蛋白的表达纯化和解螺旋酶活性的分析

Pif1解螺旋酶家族在酵母到人的进化中非常保守, 在生物体内具有很多重要的生理作用。为了从生物化学水平研究人类PIF1的功能, 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到人类PIF1全长基因, 通过共转化一个携带稀有遗传密码tRNA1的质粒和一个编码分子伴侣的质粒, 增加了PIF1蛋白在大肠杆菌中的表达, 最后通过快速液相色谱纯化系统, 采用亲和层析和凝胶过滤, 纯化了人类重组PIF1蛋白。生物化学活性检测证明了纯化的人类PIF1蛋白具有ATP酶及解螺旋酶活性。人类PIF1蛋白的纯化为我们从分子水平理解PIF1在体内的功能奠定了基础。