胞浆识别受体NODs及其信号通路在侵袭性肺曲霉病中的作用

【目的】研究天然免疫系统中胞浆识别受体NODs及其信号通路在小鼠侵袭性肺曲霉病(IPA)中的作用。【方法】小鼠随机分为正常对照组、正常+接种烟曲霉菌组(正常感染组)和免疫抑制+接种烟曲霉菌组(IPA组),经鼻吸入烟曲霉孢子后在不同时相点处死小鼠,无菌取肺组织分别进行病理切片,烟曲霉菌落计数,RT-PCR法、Western blot法动态检测小鼠感染烟曲霉菌过程中肺组织NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表达,促炎细胞因子TNF-α含量的变化规律。【结果】鼻吸入烟曲霉菌后72 h时,IPA组肺组织出现严重炎症反应,并有大量的菌丝生成,同时各时相点的烟曲霉菌负荷均高于正常感染组;与正常感染组比较,IPA组NOD1、RIP2 mRNA持续低表达,而NOD2 mRNA则在感染最早期(24 h)异常高表达,而在随后的感染过程中一直处于低表达状态;正常小鼠感染烟曲霉菌后,肺组织中促炎细胞因子TNF-α在感染前期皆呈高表达,且最高表达量均出现在48 h或72 h,之后下降并恢复至正常水平。而IPA小鼠促炎症细胞因子TNF-α缓慢且低水平释放。【结论】NOD1、RIP2的表达受到长期抑制,NOD2在感染最早期的过度激活以及随后的抑制表达,引起促炎细胞因子低表达,可能导致了侵袭性肺曲霉的发生发展。     

内毒素耐受对核苷酸结合寡聚化结构域2信号通路的影响

为研究内毒素耐受对核苷酸结合寡聚化结构域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2,NOD2)信号通路的影响,将小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7分为两组,分别给予小剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(100ng/mL)或磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)预处理20h,建立内毒素耐受组和对照组。每组细胞分别给予大剂量LPS(1 000ng/mL)或热灭活烟曲霉孢子刺激,于刺激后0、2、6、12、24h采用定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测细胞NOD2、受体相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2,RIP2)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)mRNA表达;采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)和TNF-α浓度。结果显示,内毒素耐受组无论是大剂量LPS还是热灭活烟曲霉孢子刺激均不能增加NOD2、RIP2和TNF-αmRNA表达及细胞上清液中IL-8、TNF-α浓度;而对照组大剂量LPS和热灭活烟曲霉孢子刺激均可提高NOD2、RIP2和TNF-αmRNA表达及细胞上清液中IL-8、TNF-α浓度,尤以刺激后12h增加显著,与刺激前(0h)比较,差异有统计学意义(P0.05)。结果提示,内毒素耐受可能对NOD2信号通路有抑制作用。     

nAChRα1调控尼古丁促进巨噬细胞RAW264.7增殖迁移的作用研究

目的:探讨nAChRα1是否参与调节尼古丁促进巨噬细胞RAW264.7增殖迁移的作用。方法:将体外培养的RAW264.7细胞分4组为:(1)正常对照组;(2)尼古丁组;(3)对照干扰+尼古丁组;(4)nAChRα1干扰+尼古丁组。用尼古丁(5 ng/mL)刺激巨噬细胞RAW264.7,特异性nAChRα1 si RNA用脂质体3000转染细胞,CCK-8法检测尼古丁处理3 h、24 h和48 h后细胞的增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Western blot和RT-PCR检测细胞内nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA的表达情况。结果:与空白对照组相比,尼古丁可显著促进RAW264.7细胞的增殖和迁移,增加nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达;而在干扰nAChRα1表达后,尼古丁诱导的RAW264.7细胞的增殖和迁移明显被抑制,且细胞nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达均显著的降低。结论:nAChRα1可介导尼古丁促进RAW264.7细胞的增殖和迁移,这可能与其参与调控尼古丁增加RAW264.7细胞分泌MMP-2、MMP-9有关。     

SCARF1 在人THP-1 单核源性巨噬细胞抗烟曲霉菌刺激中的作用

目的:运用干扰腺病毒沉默THP1细胞中SCARF1基因研究其在体外抗烟曲霉中的作用。方法:用灭活的烟曲霉分生孢子(1×105 CFU/m L)于不同时间点处理THP-1细胞,RT-PCR分别检测SCARF1和TNF-αm RNA的表达;将Ad-si RNA-SCARF1转导细胞24 h后给予烟曲霉孢子刺激24 h,通过RT-PCR法检测细胞中TNF-αm RNA表达,Western blot法检测细胞中SCARF1表达以及NF-κB通路相关信号分子的活性。结果:RT-PCR证实烟曲霉孢子刺激能时间依赖性增强THP1细胞中SCARF1和TNF-α表达;Western法证实与Ad-GFP组比较Ad-si RNA-SCARF1组SCARF1的表达量显著降低(P0.05),沉默效率为71%;与Ad-GFP组比较,Ad-GFP+Af组NF-κB亚单位p65的磷酸化水平明显升高(P0.05),在Ad-si RNA-SCARF1+Af组,磷酸化p65的产生明显减少,SCARF1沉默后细胞因子TNF-α的分泌明显减少。结论:烟曲霉孢子刺激能诱导巨噬细胞SCARF1的表达增加,诱导信号分子NF-κB的活化,导致相应的细胞因子分泌增加,从而在巨噬细胞抗烟曲霉中发挥作用。     

红毛五加多糖单一组分AHP-Ⅲ对巨噬细胞的免疫调节作用及其机制

探讨红毛五加多糖(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharide)单一组分AHP-Ⅲ(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharideⅢ)对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的激活作用及机制。不同浓度AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞,中性红试验检测细胞吞噬能力;ELISA和Griess法检测其IL-6、TNF-α和NO的释放量;RT-qPCR检测iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平;Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化水平。在实验浓度范围内,AHP-Ⅲ可显著增强RAW 264.7细胞的吞噬能力(P<0.05);促进RAW 264.7分泌NO、TNF-α和IL-6(P<0.05或P<0.001);并显著增加RAW 264.7细胞中IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达量,呈剂量依赖性;Western blot结果表明,AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞后,NF-κB中的p65、IKKβ、IκBα磷酸化水平明显升高。结果显示红毛五加多糖AHP-Ⅲ对小鼠巨噬细胞RAW 264.7具有显著激活作用。     

连翘脂素对LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应的影响

为研究连翘脂素的抗炎效应及其抗炎机制,以地塞米松作为阳性对照,建立脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,检测炎症因子的释放及相关蛋白和mRNA的表达,以期提高对连翘脂素抗炎作用的全面认识并为连翘脂素临床开发提供有力的科学依据。实验采用Griess法检测细胞上清液中NO含量,ELISA法检测TNF-α和IL-6的含量,Westernblot法检测iNOS、COX-2蛋白的表达,RT-qPCR法检测iNOS、COX-2mRNA的表达。与LPS组比较,连翘脂素组和地塞米松组可以明显降低LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6的量,并呈现浓度依赖关系。Westrenblot和RT-qPCR结果显示连翘脂素能抑制LPS诱导的iNOS、COX-2的蛋白表达以及mRNA的表达,并呈浓度依赖关系。实验研究表明连翘脂素能够明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的释放,iNOS、COX-2蛋白及mRNA的表达从而抑制炎症反应。     

LncRNA-GAS5对BCG感染小鼠巨噬细胞后细胞坏死的调控作用

【背景】LncRNA-GAS5是由Gas5基因编码的功能性LncRNA分子,对细胞极化、细胞凋亡、坏死和自噬等多种生物学过程具有重要的调控作用。【目的】探讨LncRNA-GAS5对卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7坏死的调控作用。【方法】构建LncRNA-GAS5的过表达及干扰载体,分别转染巨噬细胞RAW264.7后使用BCG感染,采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率,通过透射电镜观察细胞坏死形态,利用碘化丙啶(Propidine iodide,PI)单染法流式细胞仪检测细胞坏死率,通过实时荧光定量PCR和Western blot法研究坏死相关调控因子RIP1、RIP3和MLKL的表达水平。【结果】BCG感染巨噬细胞后,LncRNA-GAS5表达水平显著上调;同时,采用LncRNA-GAS5过表达载体单独转染或结合BCG感染后,巨噬细胞存活率均下降且细胞坏死率显著增加。同时坏死关键调控因子RIP1、RIP3和MLKL的mRNA及蛋白表达水平均显著上调(P0.001),而GAS5干扰载体可有效抑制这一效果。【结论】LncRNA-GAS5通过上调坏死相关因子RIP1、RIP3及MLKL的表达促进BCG感染巨噬细胞后诱导的细胞坏死,研究结果为进一步探讨LncRNA-GAS5对BCG感染巨噬细胞后细胞坏死调控的分子机制奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌外膜囊泡激活caspase-11和NLRP3炎性体诱导炎性细胞因子IL-1β和IL-18分泌

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体诱导炎性因子表达过程中的关键作用。【方法】副猪嗜血杆菌OMVs感染RAW264.7细胞,收集6、12和24h细胞,RT-PCR检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达;收集感染后48 h细胞,Western blotting检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达。收集感染后6、12、24、48和72h细胞上清,ELISA检测interleukin(IL)-1β和IL-18表达水平;不同浓度OMVs(0、2.5、10、25、50和100μg/mL)感染RAW264.7细胞24h,ELISA检测上清中IL-1β和IL-18水平。构建caspase-11沉默RAW264.7细胞株,收集OMVs感染后12、24和48h细胞培养上清检测IL-1β和IL-18水平。【结果】Caspase-11 mRNA转录水平在OMVs感染6、12和24h均极显著高于对照组(P<0.01);NLRP3 mRNA转录水平在感染后6、24h极显著高于对照组(P<0.01);ASC mRNA转录水平在感染后12、24h显著低于对照组(P<0.05);caspase-1 mRNA转录水平在感染后6、12和24h显著高于对照组(P<0.05)。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,OMVs组caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达均明显升高。OMVs感染RAW264.7细胞后12、24、48和72h,IL-1β表达量极显著高于对照组(P<0.01),而且呈现时间依赖性升高,IL-18表达水平在感染后6、12、24、48和72h显著高于对照组(P<0.05);不同浓度OMVs感染细胞时,OMVs对细胞的致炎作用呈现剂量依赖性增强。Caspase-11沉默后,IL-1β水平在感染后12、24和48h显著低于未沉默组;Caspase-11沉默组IL-18表达量在感染后24、48h均显著低于未沉默组(P<0.05)。【结论】副猪嗜血杆菌OMVs在副猪嗜血杆菌诱导的炎症反应中发挥重要作用,OMVs可诱导RAW264.7细胞caspase-11介导的非经典NLRP3炎性体信号通路活化。     

肠球菌溶血及非溶血菌株对小鼠巨噬细胞表达TNF-a的影响

【目的】探讨肠球菌溶血菌株及非溶血菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7表达TNF-а的影响。【方法】用多粘菌素B抑制排除内毒素污染对实验的影响。肠球菌溶血菌株、非溶血菌株各11株,以菌/细胞比 30∶1 感染RAW264.7细胞1 h,加入200 mg/mL氨苄青霉素继续培养24 h,分别于感染后3、6、9、24 h,用ELISA方法检测不同观测点细胞培养液中肿瘤坏死因子TNF-a的含量,并用逆转录-聚合酶链反应方法（RT-PCR）比较肠球菌溶血、非溶血菌株感染6 h后TNF-a mRNA表达的差异。【结果】未感染的RAW264.7细胞培养液中检测不到TNF-a。肠球菌溶血株感染组细胞培养上清液中各观测点的TNF-a的平均含量 (pg/mL) 均比非溶血株性组高。经t检验,P<0.01,差别有显著性。RT-PCR法检测其mRNA的表达也有相同结果：TNF-a mRNA在肠球菌溶血株感染细胞中的相对表达量比非溶血株感染的细胞高,经t检验,P<0.05,差别有统计学意义。【结论】肠球菌溶血株比非溶血株更能促进小鼠巨噬细胞RAW264.7产生TNF-а炎症因子。     

黄芩苷对脂多糖诱导的巨噬细胞NF-κB活化和炎症因子表达的影响

目的:研究黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表达的影响.方法:分别用LPS(终浓度1μgomL-1)和LPs+黄芩苷(终浓度10,50,100μmol moloL-1)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,用RT-PCR法和Elisa法检测细胞及其上清液中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达变化,用Western Blot法检测细胞核内NF-κB p65蛋白含量变化.结果:LPS刺激RAW264.7细胞可导致NF-κB激活,上调TNF-α、IL-6表达;黄芩苷预处理能降低LPS诱导的NF-κB出活化和TNF-α、IL-6表达.结论:黄芩苷可通过抑制NF-κB活化,下调LPS诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-6的生成,发挥抗炎作用.这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一.     

绝经后骨质疏松症TNF-α通过激活NF-κB促进RANKL诱导的破骨细胞形成

本研究检测了绝经后骨质疏松症妇女的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和雌激素水平,并探讨了TNF-α对破骨前体细胞RAW264.7中破骨细胞标志物核因子κB受体激活因子(nuclear factor kappa-B, RANK)、组织蛋白酶K (Cathepsin K, CTSK)和凝血酶受体激活肽(thrombin receptor activating peptide, TRAP)以及核因子-κB (NF-κB)亚基(p65)和NF-κB抑制蛋白(IκBα)的影响。研究结果表明,绝经后骨质疏松症患者的TNF-α水平显著升高,而雌二醇水平显著降低。核因子κB受体激活因子配体(receptor activator for NF-κBligand, RANKL)处理1周后,破骨前体细胞RAW264.7中破骨细胞标志物RANK、CTSK和TRAP的mRNA和蛋白高度表达。与RANKL对照组相比,TNF-α处理可上调RANK、CTSK和TRAP m RNA的表达。但是,仅TNF-α不能诱导培养的RAW264.7细胞分化为破骨细胞成。TNF-α以剂量依赖性方式诱导NF-κB亚基p65和IκBα磷酸化,而NF-κB抑制剂处理则有效降低了RANK和TRAP的表达。本研究结论表明,绝经后骨质疏松症中TNF-α通过激活NF-κB来促进RANKL诱导的破骨细胞形成。     

不同形态的烟曲霉对巨噬细胞自噬水平的影响

目的探究烟曲霉静息孢子、膨胀孢子以及菌丝对巨噬细胞自噬水平的影响。方法培养烟曲霉并收获静息孢子,在沙保弱液体培养基中振荡不同时间获得膨胀孢子及菌丝。以3种形态的烟曲霉分组处理RAW264.7细胞,免疫印迹法检测LC3BⅡ蛋白的表达量,逆转录PCR检测自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12 mRNA的转录水平。观察不同形态的烟曲霉刺激GFP-LC3B-RAW264.7细胞后GFP-LC3B的表达与定位。结果膨胀的烟曲霉孢子及菌丝刺激巨噬细胞后LC3BⅡ表达水平升高;Atg5与Atg12 mRNA的转录均明显增高,Atg7转录水平无显著变化;膨胀孢子诱导LC3B呈斑点样聚集并与之共定位,烟曲霉菌丝刺激后自噬体增多。结论烟曲霉膨胀孢子与菌丝能显著提高巨噬细胞自噬水平,静息的分生孢子不能引起巨噬细胞自噬功能的应答。     

In vitro model to estimate gut inflammation using co-cultured Caco-2 and RAW264.7 cells

A system for assessing the anti-inflammatory effect of food factors was developed by establishing a co-culture system with intestinal epithelial Caco-2 cells (apical side) and macrophage RAW264.7 cells (basolateral side). In this system, the stimulation of RAW264.7 cells with lipopolysaccharide was followed by a decrease in transepithelial electrical resistance, which is a marker of the integrity of the Caco-2 monolayer and an increase in TNF-α production from RAW264.7 cells and IL-8 mRNA expression in Caco-2 cells. Treatment with anti-TNF-α antibodies or budesonide suppressed in increase in TNF-α production and IL-8 mRNA expression. These results indicated that this co-culture model could imitate the gut inflammation in vivo. In addition, fucoidan, sulphated polysaccharides from brown algae, was employed as a candidate of evolution and added to the apical side of this model. Fucoidan suppressed IL-8 gene expression through a reduction in TNF-α production from RAW264.7 cells stimulated with lipopolysaccharide.     

Different Suppressive Effects of Fucoidan and Lentinan on IL-8 mRNA Expression in in Vitro Gut Inflammation

A system for assessing the anti-inflammatory effects of food factors was developed by establishing a co-culture system with intestinal epithelial Caco-2 cells and macrophage RAW264.7 cells. The results indicate that fucoidan and lentinan exhibited different suppressive effects on interleukin-8 (IL-8) mRNA expression in Caco-2 through tumor necrosis factor-α (TNF-α) production from RAW264.7 stimulated with lipopolysaccharide (LPS).     

β-Glucan from Lentinus edodes inhibits nitric oxide and tumor necrosis factor-α production and phosphorylation of mitogen-activated protein kinases in lipopolysaccharide-stimulated murine RAW 264.7 macrophages

Lentinan (LNT), a β-glucan from the fruiting bodies of Lentinus edodes, is well known to have immunomodulatory activity. NO and TNF-α are associated with many inflammatory diseases. In this study, we investigated the effects of LNT extracted by sonication (LNT-S) on the NO and TNF-α production in LPS-stimulated murine RAW 264.7 macrophages. The results suggested that treatment with LNT-S not only resulted in the striking inhibition of TNF-α and NO production in LPS-activated macrophage RAW 264.7 cells, but also the protein expression of inducible NOS (iNOS) and the gene expression of iNOS mRNA and TNF-α mRNA. It is surprising that LNT-S enhanced LPS-induced NF-κB p65 nuclear translocation and NF-κB luciferase activity, but severely inhibited the phosphorylation of JNK1/2 and ERK1/2. The neutralizing antibodies of anti-Dectin-1 and anti-TLR2 hardly affected the inhibition of NO production. All of these results suggested that the suppression of LPS-induced NO and TNF-α production was at least partially attributable to the inhibition of JNK1/2 and ERK1/2 activation. This work discovered a promising molecule to control the diseases associated with overproduction of NO and TNF-α.