B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。     

A型肉毒毒素Hc结构域在大肠杆菌中的高水平表达及免疫原性

对A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的全序列进行优化和人工合成,获得了全长1287bp,编码429aa的Hc基因。以pTIG-Trx为原核表达载体,实现了Hc在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化,该表达水平可占可溶性全菌总蛋白的36%～53%,经一步亲和层析纯化可获得电泳级纯度的目的蛋白,在常规培养条件下,产量达到30mg/L以上。然后,纯化的重组蛋白Hc免疫小鼠后能够诱导产生高滴度特异性的抗体,也能诱导产生特异性的细胞免疫应答反应。小鼠体内A型肉毒毒素中和试验结果表明免疫组小鼠血清中含高滴度的体内中和抗体。结果表明,利用本实验的原核表达系统不仅能够高水平可溶性地表达A型肉毒毒素受体结合区Hc,而且重组Hc具有良好的免疫原性,可以用于制备治疗性抗毒素和作为亚单位候选疫苗用于预防A型肉毒毒素中毒。     

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的：通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原He（Bont／B-He）。方法：对Bont／B-He基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将（C＋C）含量由76．2％降至56-3％;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont／B-He的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）感受态细胞,用IPTC诱导Bont／B-He的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论：目的蛋白在大肠杆菌B121（DE3）中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26．7％,表达量达到30mg／L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3％,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体融合蛋白的重组设计

以获得的抗A型肉毒毒素单链抗体为模板,进行融合改构,将人IgGl的Fc片段连接到ScFv的C端,在大肠杆菌中实现抗体融合蛋白ScFv—Fc的表达,表达量30％以上,蛋白以包含体形式存在,经过体外变复性的抗体融合蛋白ScFv．Fc,进行Protein G Sepharose柱亲和层析纯化,纯度达90％-95％。体外活性检测结果表明,重组抗体融合蛋白ScFvFc可以特异结合A型肉毒类毒素抗原,其相对亲和力近似于母本单链抗体,其稳定性高于母本单链抗体。     

不同血清型肉毒毒素受体结合域研究进展

肉毒毒素(botulinum neurotoxin, BoNT)是人类已知毒性最强的蛋白质之一,可以引起肌肉松弛麻痹,严重时可导致死亡。肉毒毒素共分为7种血清型(BoNT/A-BoNT/G),根据氨基酸序列差异可进一步分为40多种亚型。肉毒毒素分子结构由3个基本结构域组成：重链羧基端细胞受体结合域、氨基端的易位域和轻链催化域。在运动神经元表面,受体结合域首先与聚唾液酸神经节苷脂结合,随后与突触囊泡蛋白2或突触囊泡结合蛋白结合形成双受体复合物。每种血清型的受体结合域都必须与其相应受体结合才能发挥作用。肉毒毒素的结构功能及其对宿主的作用一直都是研究热点。近年来,因受体结合域可以促进肉毒毒素与运动神经元膜特异性结合,而成为新的研究方向。本综述将概述不同血清型肉毒毒素与受体结合过程中受体结合域结构变化和结合位点差异。通过分析不同血清型及亚型的序列以及受体结合域结构特征,可以更好地了解细胞受体结合域的序列差异和功能,并为肉毒毒素的治疗策略提供新思路。     

B型肉毒毒素重链C端基因的表达与保护作用的初步研究

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G),是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质。人类肉毒中毒主要是由A、B和E型引起。本研究克隆了B型肉毒毒素重链C端片段(Hc),在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用Ni离子亲和柱进行了纯化。Hc蛋白免疫后的BALB/c小鼠可以抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻击。     

肉毒毒素及其检测方法研究进展

肉毒毒素是自然界中毒性极强的一类神经麻痹毒素,可引起人类和动物肉毒中毒。因其制备简单、毒性强,已被列为最具威胁的生物恐怖剂之一,同时也是重要的毒素战剂。其感染剂量极低,每个人都易感。肉毒中毒后,病情严重者一般2-3 d内即可能死亡。如采取正确及时的治疗,可使肉毒中毒死亡率降低,而快速检测方法的建立无疑是成功治疗的前提。本文就肉毒毒素及其检测方法做一综述。     

PPF1基因C端片段在大肠杆菌中的融合表达和纯化以及抗体制备

PPF1是与G2豌豆短日不衰老现象紧密相关的基因之一 .以pSK PPF1为模板 ,用PCR方法得到了编码该蛋白C端的基因片段 ,称为PPFC .进一步将该基因片段克隆到中间载体pGEM T easy ,再酶切得到PPFC片段插入到pGEX 4T 1载体中 ,构建成表达质粒pGEX 4T PPFC .在BL2 1细胞中经IPTG诱导表达 ,得到GST PPFC融合蛋白 .用GST亲和柱纯化得到PPFC蛋白 ,将其作为抗原得到兔源的多克隆抗体 .Western杂交分析表明所得到的抗体具有较强的特异性 ,ELISA分析证实其效价为 10 6.该抗体的获得为用免疫沉淀等免疫分析技术研究PPF1与其它蛋白质的相互作用 ,从而阐明PPF1在延缓G2豌豆衰老中的分子机制提供了可能     

A型肉毒毒素在国内外的临床应用

在介绍Ａ型肉毒毒素结构、功能及性质的基础上,对其应用于临床治疗中的国内外情况进行了综述,旨在为此毒素的应用提供理论依据及实践经验,并指出以后应深入研究的重点,以使该毒素的临床应用更趋完美。     

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

 从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .     

天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链融合基因的克隆及原核表达分析

构建了霍乱毒素B亚单位(choleratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素(insulin)B链的融合基因CTB-INSB,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pETCIB;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经IPTG诱导后的表达产物经15％SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,其分子量约为15.4kDa,且主要以包涵体形式存在,约占全菌蛋白的30％。含CTB-INSB重组蛋白的包涵体经变性和复性后,可在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果显示CTB-INSB可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别,表明该蛋白具有霍乱毒素B亚单位与胰岛素的双重抗原性。同时GM1-ELISA分析结果表明CTB-INSB在体外可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异结合,进一步证实了它能够形成类似CTB五聚体的高级结构,具有生物活性。     

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的：建立颗粒裂解肽（NKG5）的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法：采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEx-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B纯化重组蛋白。结果：重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论：获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

Status of Cys Residues in the Covalent Structure of Botulinum Neurotoxin Types A, B, and E

Clostridium botulinum neurotoxin (NT) serotypes A, B, and E have 9, 10, and 8 Cys residues, respectively, as deduced from nucleotide sequences [Whelan et al. (1992), Appl. Environ. Microbiol. 48, 2345–2354]. Each of the 150-kDa NTs has at least one disulfide; but type B, like types A and E, may have two disulfides. Using two different chemical reagents, we studied the status of the Cys residues in these three proteins after (i) the final anion exchange chromatographic step in their purification (fresh NT), (ii) 24 hr storage at 8°C, (iii) precipitation with ammonium sulfate (precipitated NT), and (iv) dissolving the precipitated NT in 6 M guanidine·HCl. In all three NT serotypes the number of Cys residues titrated with 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) as free -SH groups varied, depending upon the absence or presence of EDTA added to the chromatography buffer, storage condition, age, and presence of the denaturant. Titration of 9.5–10 and 5.4–6.0 -SH groups in fresh NTs type B and E, respectively, indicated total and partial absence of disulfide bonds. Fewer titratable -SH groups in the precipitated NT than in the fresh NT suggested formation of disulfide and/or inaccessibility of the -SH groups due to protein's conformational change(s). When the precipitated NTs were dissolved in 6 M guanidine·HCl, in the absence of any added reducing agent, all Cys residues of types B and E, and 6.4–8.3 Cys in type A NT were titratable with DTNB. Iodoacetamide modification of precipitated NT types A, B, and E carboxymethylated 4, 2, and 2 Cys residues, respectively; these numbers rose to 6, 9.4, and 8 when these proteins were carboxymethylated after dissolving in 6 M guanidine·HCl in the absence of any added reducing agent. We propose that -S-S- cleavage mediated by the -SH/-S-S- exchange observed in vitro after unfolding the NTs (also unfolded by 2 M guanidine·HCl or urea) possibly mimicks a similar exchange process inside the endosomes, where the NTs are thought to undergo conformational changes, resulting in the reductive cleavage of the interchain disulfide between the 50-kDa light and 100-kDa heavy chain, which in turn releases the light chain and allows its egress out of the endosomes into the cytosol.     

NADH-细胞色素b5还原酶在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

为了探讨 NADH-细胞色素 b5还原酶基因突变引起遗传性高铁血红蛋白血症的分子病理机制 ,研究突变型 ( b5R)蛋白结构和功能的关系 ,用基因重组技术将野生型和突变型 ( C2 0 3Y) b5Rc DNA克隆于 p GEX- 2 T载体 ,在大肠杆菌 BL2 1中诱导表达 .Western印迹鉴定所表达的蛋白为GST- b5R融合蛋白 .应用谷胱甘肽 - Sepharose 4B亲和层析 ,还原型谷胱甘肽洗脱得到纯化的GST- b5R和 GST- b5RC2 0 3Y融合蛋白 .比较 GST- b5R和 GST- b5RC2 0 3Y酶活性及稳定性 ,发现野生型和突变型的酶活性基本相同 .但与野生型酶相比 ,突变型酶对热的稳定性较差 ,对胰蛋白酶更加敏感 .结果提示 ,C2 0 3Y突变可引起蛋白质二级结构改变而导致酶的稳定性下降 .     

弗氏志贺菌5a 型 M90T 株 ClpB 蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的：构建弗氏志贺菌cZp8基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果：PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574bp的c加曰基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法（LIC）进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1mmol／LIPTG诱导2h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×10^3的ClpB-T7融合蛋白。结论：实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

A型肉毒毒素保护性抗原的基因修饰及高效表达

在A型肉毒毒素保护性抗原基因初步表达的基础上,为提高表达水平,依据EMBL的DNA数据库中A型肉毒毒素基因全序列,重新设计上游引物,通过修饰基因片段N端,保持氨基酸序列不变,从已获得的A型肉毒毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因中,扩增小的突变基因,克隆入pGEM-T载体进行测序,并以pBV220为表达载体构建重组表达质粒,在大肠杆菌中实现高效表达。结果表明,重组表达产物占全菌蛋白的40%,酶联检测重组表达产物具有特异结合活性。A型肉毒毒素保护性抗原基因的高效表达,为下一步基因工程抗毒素和疫苗的研制奠定了基础。     

HIV-1融合蛋白MA4-CA在大肠杆菌中的高效表达

将HIV-1MA4-CA融合基因克隆到高效表达载体pBV220中,将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS—PAGE检测。结果表明,成功地构建了含MA4-CA融合基因的表达载体pBV220-MA4-CA,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为16000并以包涵体形式存在的融合蛋白,此蛋白经洗涤后能够溶于8mol／L的尿素中。利用硫酸铵沉淀法进行初步纯化后即可得到纯度比较高的MA4-CA融合蛋白,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。