毛竹CCR基因家族成员生物信息学和表达模式分析

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是木质素生物合成的关键酶之一,对木质素生物合成途径的碳流具有重要的调控作用。研究毛竹(Phyllostachys edulis) CCR基因的分子特征和表达模式对于揭示影响竹子材性的木质素调控机制具有重要意义。采用同源序列比对的方法在毛竹基因组中获取13个CCR基因同源序列,其中9个具有完整的保守结构域,依次命名为PeCCR1～PeCCR9。PeCCRs基因的内含子数量、长度和位置均存在较大差异,如PeCCR2有5个内含子,而PeCCR5没有内含子;内含子最长的为4 090 bp,最短的仅为89 bp。PeCCRs编码的氨基酸序列长度范围为136～391 aa,推测分子量在14.97～43.05 kD之间,理论等电点介于5.60～8.31之间。PeCCRs的氨基酸序列在N-端和C-端均存在明显的差异,二级、三级结构进一步显示了其差异,但中部序列具有很高的一致性,都含有肉桂酰辅酶A还原酶家族蛋白特有的保守结构域和催化位点,表明其进化上是比较保守的。基于转录组数据的基因组织表达特异性分析表明,PeCCRs在各组织中的表达量差异明显,如PeCCR6在盛花期花序、鞭和笋中均未检测到基因表达,PeCCR9在盛花期花序中的表达是所有PeCCRs最高的,而PeCCR5在50 cm笋中则是所有检测到PeCCRs中最低的。本研究为进一步研究毛竹CCR基因家族成员的功能提供了参考,为利用基因工程调控竹子木质素提供了依据。     

罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。     

小麦中两个肉桂酰辅酶A还原酶基因的分离和表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）负责催化木质素单体生物合成中最重要的代谢反应,它将类苯丙酸类代谢物转移到木质素的合成途径中,为了更好地了解木质素在小麦生长发育中的作用,从小麦（Triticum aestivum L.ev,H4564)中克隆了两个肉桂酰辅酶A还原酶的cDNA,相似性和进化关系的分析表明这两个cDNA片段分别属于不同的肉桂酰辅酶A还原酶,这两个cDNA片段分别命名为W－cr6和W-cr19,RT-PCR和Northen杂交结果证明,W－cr6基因主要在小麦的茎和叶中表达,W－cr19基因主要在根和茎中表达,上述结果表明在小麦的基因组中至少存在两类肉桂酰辅酶A还原酶基因。     

白蜡虫far3基因cDNA全长克隆、原核表达和酶活分析

脂酰辅酶A还原酶(FAR)可将脂酰辅酶A还原为相应的脂肪醇,在白蜡生物合成中起至关重要的作用。本研究通过cDNA末端快速扩增技术获得白蜡虫Ericerus pela far3基因cDNA全长,其开放阅读框(ORF)1 566 bp。对白蜡虫FAR3编码蛋白进行系统发育分析,发现FAR3与人类Homo sapiens、小鼠Mus musculus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster等物种的FAR聚为一支;成功构建pET-30a eGFP/EpelFAR3原核表达质粒,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞,在浓度为0.05 mmol·L^-1的异丙基硫代半乳糖苷诱导6 h后有较高的蛋白表达量;经Western blot验证,表达蛋白分子量与预估蛋白分子量符合;质谱分析蛋白质分值为3 900,肽段覆盖度74%,所得肽段与理论序列相符;利用底物C24脂酰辅酶A、C26脂酰辅酶A、C28脂酰辅酶A和C30脂酰辅酶A对原核表达蛋白进行活性分析,利用气相色谱进行蛋白活性验证,没有理论产物相应脂肪醇的生成。本研究中白蜡虫far3 cDNA ORF的获得及原核表达的实现,为进一步的功能和组织表达定位研究奠定了基础。     

中间锦鸡儿CCR2和CCR3基因的克隆和功能鉴定

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase,CCR)是催化木质素合成特异途径的第一个限速酶,对木质素的合成起关键作用。从中间锦鸡儿中克隆了两个CCR基因,CiCCR2和CiCCR3,其中CiCCR2基因开放阅读框为897bp,编码299个氨基酸,CiCCR3基因开放阅读框为966bp,编码322个氨基酸。过表达CiCCR2和CiCCR3转基因拟南芥株系幼苗期和成熟期木质素含量均高于野生型,组织化学染色也表明转基因株系木质素积累较野生型拟南芥多,且转基因株系鲜重和干重显著高于野生型。     

铁皮石斛DoSMT2基因的克隆与表达分析

为了解SMT2基因在铁皮石斛（Dendrobium officinale）甾醇代谢过程中的作用,利用RACE技术克隆到1个DoSMT2基因,开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸,DoSMT2相对分子量为40.345 kD,理论等电点为8.13,属于稳定的亲水性蛋白。经BLAST P检索,DoSMT2蛋白属于AdoMet-MTases超级家族,含有4个S-腺苷蛋氨酸结合位点、1个甲基转移酶保守结构域和1个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域。系统进化分析表明,DoSMT2与深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）的SMT2亲缘关系最近,确定其属于SMT2家族。qRT-PCR分析结果表明,DoSMT2基因在茎和叶都能表达,10月份的表达量最高,叶片的表达量显著高于茎,推断叶片的甾醇代谢比茎活跃。构建了pET-29a-DoSMT2原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达出预期大小的蛋白。这为铁皮石斛DoSMT2的甲基化机制及甾醇化合物代谢研究奠定基础。     

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

龙眼DlPPO1基因的克隆及其表达调控分析

该研究根据同源克隆技术,利用RT-PCR和RACE技术,以‘四季蜜’龙眼叶片cDNA为模板,获得龙眼多酚氧化酶基因(polyphenol oxidase,PPO)的3个转录本DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的cDNA全长序列(KM387405、KM516087和KM516088)和1条DNA序列DlPPO1(KU837229)。DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的全长分别为1 969、1 960和1 920bp,包含相同的完整开放阅读框1 800bp并编码599个氨基酸;该基因与荔枝、橄榄和枣等物种的PPO基因同源性较高。生物信息学分析表明,DlPPO1保守结构域具有多酚氧化酶的典型结构域特征。利用实时荧光定量PCR技术检测DlPPO1表达结果表明,在龙眼体胚发生过程中,DlPPO1从心形胚时期开始上调表达至子叶胚时期达到最高,推测其在龙眼体胚发生中后期可能发挥重要作用;DlPPO1在龙眼叶片中表达量最高,其次是花芽,而在其他组织部位表达量较低。激素和非生物胁迫处理下的表达分析表明,水杨酸(SA)、低浓度茉莉酸甲酯(MeJA)、NaCl、甘露醇及PEG可诱导DlPPO1基因上调表达,这些表达模式暗示其可能参与多种非生物胁迫应答过程。     

香鱼甘油-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

GPDH(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)是合成脂肪代谢中间产物甘油-3-磷酸的关键酶。通过设计简并引物从香鱼肝cDNA文库中克隆GPDH基因,该基因cDNA序列全长577个核苷酸,单一大的开放阅读框编码一个由351个氨基酸组成的分子量为37.9kD的蛋白。蛋白序列分析表明,香鱼GPDH(aGPDH)与亚洲胡瓜鱼的GPDH序列同源性最高。系统进化树分析表明,GPDH的物种进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致。实时荧光定量PCR结果显示,aGPDH基因在香鱼肝、脾、肾、脑、心和肌肉组织均有表达。香鱼咸淡水适应以后,肝、脾、脑、心和肌肉的aGPDH的mRNA表达水平下调。成功构建重组表达质粒pET-32a-GPDH。SDS-PAGE试验表明,目的蛋白可以在大肠杆菌中大量表达;并制备了抗血清,能与目的蛋白起强的特异性反应,但不与细菌自身蛋白起反应。本研究有助于进一步理解鱼类盐度适应过程中的脂肪代谢调控机制。     

油葵HaGPAT1基因的克隆及表达分析

该研究利用RT-PCR技术,从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因(HaGPAT1),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测该基因在不同组织、种子不同发育时期以及不同胁迫条件下的表达特征。结果表明:HaGPAT1基因全长为1 656bp,编码551个氨基酸,相对分子量为62.132kD,等电点为8.84。系统进化树分析表明,HaGPAT1蛋白与高等植物莴苣的GPAT1亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,HaGPAT1基因在油葵花蕊中的表达水平最高,开花后17d的种子中次之;在干旱和盐胁迫条件下,HaGPAT1基因的表达水平均显著上调。研究推测,HaGAT1基因可能在油葵花器官发育中发挥重要作用,并且参与了油葵对干旱和高盐的抗性调节。     

油葵HaFAD2-2基因的克隆及表达分析

脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturase,FAD2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内生成多不饱和脂肪酸的关键酶。根据已报道的向日葵(Helianthus annuus L.)FAD2基因序列,设计引物进行RT-PCR,克隆得到油葵FAD2-2基因全长cDNA,命名为HaFAD2-2。该基因开放阅读框为1 152bp,编码383个氨基酸,相对分子质量43.96kD,等电点为8.56。对基因组进行内含子调查发现,该基因在编码区内没有内含子。多序列比对和系统进化分析发现,FAD2-2基因编码蛋白与金盏菊(Calendula officinalis)、斑鸠菊(Vernonia galamensis)等菊科植物具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析表明,HaFAD2-2基因在根、茎、叶、花、子叶和未成熟种子中均有表达,且以叶中的表达量最高,未成熟种子中的表达量最低;低温(5℃、15℃)胁迫处理能显著促进该基因在根中的表达,抑制其在叶中的表达;盐胁迫(300 mmol/L NaCl)处理对其表达也具有抑制作用。该研究结果可为进一步探讨HaFAD2-2基因的功能奠定基础。     

石榴PgUFGT基因克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE方法,从石榴(Punica granatum L.)果皮中克隆到一个类黄酮糖基转移酶(UFGT)基因(PgUFGT)全长cDNA序列(GenBank登录号为KF841620)。PgUFGT基因编码区1 476bp,编码491个氨基酸。PgUFGT蛋白具有保守PSPG基序、UDP-糖基转移酶家族结构域和UDP-葡萄糖醛酸基/葡萄糖基转移酶保守域(UDPGT),与其他植物UFGT蛋白一致性较高;系统进化树分析结果表明,PgUFGT属于类黄酮3-O-糖基转移酶类。荧光定量qRT-PCR结果表明,PgUFGT基因在‘红宝石’和‘水晶甜’2个石榴品种的发育期内具有不同的表达模式,PgUFGT在‘红宝石’石榴中有2个转录表达高峰,而在‘水晶甜’石榴中仅有1个表达高峰,表明PgUFGT可能在2个石榴品种中具有不同的催化作用。该研究结果为进一步研究石榴果实色泽形成的分子机制奠定了基础。     

外源水杨酸对铝胁迫下菊芋根系分泌物的影响

为探究铝胁迫对菊芋根系分泌物的影响以及外源水杨酸(SA)的缓解作用,该文以耐铝型南京菊芋和铝敏感型资阳菊芋为试验材料,采用土培法,设置铝浓度500μmol·L^-1,分析了不同浓度(10、100、1 000μmol·L^-1)SA对铝胁迫下菊芋根系分泌物中有机酸、氨基酸以及根尖相关代谢酶活的影响。结果表明：(1)单铝胁迫会导致菊芋根系分泌物中柠檬酸、草酸、苹果酸浓度升高,且南京菊芋升高幅度大于资阳菊芋;柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶在单铝胁迫下活性增强;脯氨酸含量显著提升,总氨基酸浓度均显著减少。(2)外源SA加入后,南京菊芋根系分泌的柠檬酸、草酸、苹果酸浓度均得到不同程度提高,但经高浓度(1 000μmol·L^-1)SA处理后资阳菊芋根系分泌草酸显著降低,且在各浓度SA处理下苹果酸浓度均无明显变化;柠檬酸合酶活性出现不同程度的增强,但对南京菊芋根尖中苹果酸脱氢酶活性影响不大,且高浓度(1 000μmol·L^-1)SA处理后显著降低了资阳菊芋根尖中苹果酸脱氢酶活性;脯氨酸含量显著下降,从总氨基酸浓度变化来看,...     

去除顶端优势对菊芋器官C、N、P化学计量特征的影响

以不同时期顶端优势去除处理的菊芋为研究对象,通过测定根、茎、叶、花和块茎等器官C、N、P含量,计算C∶N、C∶P和N∶P比值,探讨顶端优势去除对菊芋各器官C、N、P化学计量特征的影响规律。结果表明:各器官之间C含量高低顺序没有因去顶而改变,氮和磷含量高低顺序因去顶而表现出不同的大小关系;顶端优势去除提高了茎秆、块茎和分枝的C含量,除最后一次顶端优势去除提高了叶片C含量,其它顶端优势去除时间均降低了叶片含量;顶端优势去除降低了根系、茎秆和块茎N含量,提高了分枝和花的含N量;顶端优势去除提高了叶片和块茎的含P量;C∶N范围为24.15—153.75、C∶P范围为118.87—2265.72、N∶P范围为2.46—24.05,N∶P平均值为10.67,说明菊芋生长主要受N元素的限制。     

枸杞蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及组织表达分析

利用RT-PCR及RACE技术,从药用植物枸杞中克隆了1个编码蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA,命名为LbSPS(GenBank登录号KC834608)。序列分析表明:LbSPS基因长3 677bp,开放阅读框为3 165bp,编码1 033个氨基酸,分子量为118.457 5kD,理论等电点6.05。系统进化分析显示,LbSPS编码的氨基酸序列与甜瓜、马铃薯、番茄等蔗糖磷酸合成酶基因编码氨基酸序列一致性为66%~98%。qRT-PCR分析显示,LbSPS基因在枸杞花中表达量最高,叶中表达水平较低。该研究为进一步了解LbSPS在枸杞生长发育、逆境胁迫等过程中的生物学功能奠定了基础。     

小桐子JcCIPK2基因的克隆与表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,参与多种生物和非生物胁迫响应过程。该实验通过RT-PCR克隆了小桐子(Jatropha curcas L.)JcCIPK2基因cDNA全长序列,采用荧光定量qRT-PCR分析JcCIPK2基因在不同组织及不同处理(12℃和1℃低温、42℃高温、30%PEG、250 mmol/L NaCl、150μmol/L ABA)下的表达模式。结果显示:(1)小桐子JcCIPK2基因开放阅读框全长1 398 bp,编码465个氨基酸,相对分子量为52.95 kD,等电点为8.89。(2)蛋白质结构分析表明,JcCIPK2的N端含有位于第11～265个氨基酸之间的丝氨酸/苏氨酸激酶_蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶3催化域STKc_SnRK3,在激酶结构域内还具有激活环(Activation Loop);C端含有位于第316～430个氨基酸之间的CIPK蛋白激酶调控域CIPK_C,其调控域中含有CIPK家族典型的能与CBL特异性结合的NAF结构域,位于第314～369个氨基酸之间。(3)系统进化分析显示,小桐子JcCIPK2蛋白与同属于大戟科的木薯(Manihot esculenta Crantz.)同源关系最近,序列一致性达87%。(4)qRT-PCR分析表明,JcCIPK2基因在小桐子根、茎、叶中均有表达,经12℃和1℃低温处理后,叶片中JcCIPK2基因的表达都呈现先上调后下调表达的趋势,且都在低温处理24 h的表达量最高,与对照相比分别上调了6.0倍和16.72倍;小桐子JcCIPK2基因在42℃高温、30%PEG、150μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl处理下也受到不同程度的诱导表达。研究推测,JcCIPK2基因在小桐子对逆境的响应与适应中起重要作用。     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。     

甘蓝型油菜BnCYP79B1基因的克隆与表达

硫苷是十字花科植物的一种次生代谢产物,其合成途径受细胞色素P450的CYP79家族蛋白的调控,该实验采用同源克隆技术在甘蓝型油菜中克隆到了CYP79B1基因,命名为BnCYP79B1(GenBank登录号为JX535391.1)。BnCYP79B1基因cDNA全长1 625bp,编码一个含有541个氨基酸、理论等电点为8.88。序列对比结果显示,BnCYP79B1与花椰菜CYP79B1在DNA序列上的相似性为98.83%,推测蛋白氨基酸序列的相似性为99.26%。通过不同时期不同部位BnCYP79B1基因表达量的分析,发现BnCYP79B1基因在高秆高硫苷品系的根中表达量较高,而对矮秆高硫苷品系则是叶中表达量较高。在BnCYP79B1表达总量上,高秆品系较矮秆品系高,高硫苷品系较低硫苷品系高。     

小桐子糖原合成激酶基因JcGSK的克隆与表达分析

以小桐子(Jatropha curcas L.)cDNA为模版,克隆了JcGSK基因的CDS序列。序列分析表明,JcGSK基因包含1 230bp完全阅读框(ORF),编码409个氨基酸。预测其编码蛋白质的相对分子量为46.33kD,理论等电点为8.58。Blast搜索结果及进化分析结果表明,JcGSK蛋白与巴西橡胶树GSK蛋白的氨基酸序列一致性最高(94%)且亲缘关系最近;JcGSK基因编码的蛋白具有一个蛋白激酶特有的结构域。组织表达结果显示,JcGSK基因在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达,且在根中表达量最高。小桐子幼苗在NaCl、ABA、PEG、低温和机械损伤处理后JcGSK基因表达量有不同程度的上调,推测其参与小桐子非生物胁迫响应和信号传导过程。JcGSK基因在种子中也有较高表达,在种子发育过程中表达量的变化与种子生长发育趋势基本一致,推测JcGSK基因也参与调控小桐子种子的生长发育。