肾综合征出血热双价纯化疫苗（Vero细胞）病毒株的筛选及其免疫原性研究

选用在Vero细胞上初步适应的LR1（Ⅰ型）、R22（Ⅱ型）株病毒,经乳鼠脑或腹腔接种,收剖感染鼠脑并在Vero细胞传代适应,此收获病毒与直接以Vero细胞传代的病毒比较表明：抗原效价、毒力滴度有明显提高。用LR1、LR22株病毒感染的Vero细胞培养物制备单价粗制疫苗和双价精制纯化疫苗免疫家兔,经空斑减少中和试验检测中和抗体,结果表明经乳鼠和Vero细胞交替传代适应后的LR1、R22株病毒具有良好的抗原性和免疫原性。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒FX株的分离和鉴定

从自然发生的鸡肾病变型传染性支气管炎病例采集病死鸡肾脏为材料,通过接种9－11日龄SPF鸡胚尿囊腔,进行病毒的分离和传代,分离到1株病毒（FX）,敏感鸡人工感染后出现呼吸症状,剖检病鸡时大我鸡肾肿大并有尿酸盐沉积,病毒能死鸡胚和产生侏儒胚;病毒能干扰鸡新城疫病毒LaSota株在鸡胚中增殖,病毒经电镜观察,其大小在80－120nm之间,囊膜外有纤,病毒经IBV单抗ELISA检测呈强阳性反应。研究结果初步表明,FX毒株为肾型IBV。     

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI) 0. 01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384～448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化; HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。     

番鸭源传染性支气管炎病毒PTFY株的分离鉴定

为弄清楚2009年7月某种番鸭养殖场产蛋高峰期番鸭产蛋率、孵化率降低,蛋质量下降的原因,选择无呼吸道症状,死亡率低,剖检可见卵巢肿大充血的番鸭。为确诊该病例,进行病原体的分离与鉴定。取病番鸭卵巢组织,通过鸡胚接种实验、脂溶剂敏感实验、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)干扰试验、电镜观察和动物接种实验进行病毒分离和鉴定。结果表明:接种鸡胚可导致侏儒胚,该毒株对于脂溶剂敏感,胰酶处理后具血凝性,可干扰NDV复制,电镜下可见典型冠状病毒形态,接种雏鸡可致呼吸道症状,针对N基因部分序列的扩增与分析可见该毒株与传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)参考毒株相应核苷酸序列同源性为84.7%~99%,鉴定所分离毒株PTFY株为IBV,证实IBV对番鸭具有致病性。     

鸡源和鹅源新城疫病毒在宿主细胞上的蚀斑形成特性及形态发生学比较

通过蚀斑形成试验比较鸡源(F48E9株)和鹅源(NA-1株)新城疫病毒在不同细胞的蚀斑形成能力,结果显示F48E9、NA-1两种病毒在Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和鹅胚成纤维细胞(GEF)上蚀斑形成能力存在明显的差异,在GEF上NA-1株的蚀斑形成能力强于F48E9株,而在CEF上弱于F48E9株,在Vero细胞上NA-1株的蚀斑形成能力稍强于F48E9株,表明病毒蚀斑形成特性与宿主种属特性一致。通过电镜观察两株病毒以相同感染量感染Vero细胞后的病毒形态发生过程。NA-1株和F48E9株病毒在Vero细胞中不同时段的形态发生的进程上存在区别,无论从出芽时间还是出芽后病毒囊膜的完整性上,NA-1株均优于F48E9株,提示NA-1株病毒对宿主环境的适应力较强。     

表达不同致病型S基因重组鸡传染性支气管炎病毒的细胞嗜性研究

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在体外进行细胞培养比较困难,并且不同来源毒株在易感性上也存在差异。为揭示IBV适应CK细胞培养的分子基础,优化其细胞培养技术,本研究首先对H120疫苗株和IBYZ分离株的分子克隆株rH120和rIBYZ,在鸡胚、鸡气管环以及原代鸡肾细胞(CK)上培养时组织细胞的嗜性差异进行了比较,结果发现rIBYZ与rH120在CK上的亲嗜性存在显著差异。在此基础之上,课题组借助前期建立的IBV反向遗传操作系统,将H120疫苗株和IBYZ株的S基因进行交叉替换,成功拯救获得2株重组病毒rH120-S/YZ和rIBYZ-S/H120。通过比较不同毒株感染CK细胞后的病变、特异性免疫荧光的强度以及病毒的增殖曲线,表明刺突蛋白(S)在IBV适应CK细胞过程中发挥决定性作用。本文揭示了S蛋白对细胞嗜性的影响,为进一步探索IBV适应细胞的分子机制奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒的RNA干扰

为探讨短的双链RNA(siRNA)对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)增殖的干扰作用,利用软件设计siRNA 1280个,75%位于Pol基因内.通过同源比较和保守性分析,筛选到针对Pol、M、N基因的12个siRNA(每个基因3～4个)作为后选目的片段,分别在Vero细胞、9日龄SPF鸡胚上进行基因干扰试验.结果,来自Pol、N靶序列的2个siRNA在Vero细胞上及鸡胚上均对IBV增殖产生明显的干扰作用,并与siRNA剂量有一定相关性,依赖于与mRNA互补的负链siRNA存在.本研究首次证实IBV增殖过程中存在siRNA干扰现象,为利用RNA干扰(RNAi)技术控制IBV提供了新手段.     

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。     

一株人源性轮状病毒的分离及适应性培养

目的:研究轮状病毒野毒株的分离方法、组织培养适应条件及相应生物学性质.方法:对收集的样品采用胶体金、PCR、PAGE进行轮状病毒定性检测.阳性样品按常规方法处理并进行组织培养分离,对不同传代样品做基因组图谱、基因序列、病毒增殖动力学分析评价,采用轮状病毒P[8]G1型阳性血清进行病毒中和鉴别试验.结果:通过检测为A组轮状病毒,基因组为4∶2∶3∶2排列,基因分型G1P [8]型,在MA104细胞中传代后转至Vero细胞上适应培养可观察到CPE;电镜观察可见典型轮状病毒形态.毒株在Vero细胞上增殖到第10代,复制稳定,且感染性滴度达到7.25 log CCID50/ml,增殖高峰为96h.中和鉴别试验证实病毒培养液只包含轮状病毒,无其他病毒污染.结论:从腹泻样品中分离得到一株人源轮状病毒毒株,命名为ZTR-68株,该分离株具有良好的组织培养适应性,遗传稳定性,为进一步研究其生物学性质和疫苗制备提供了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒的RNA干扰

为探讨短的双链RNA(siRNA)对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)增殖的干扰作用,利用软件设计siRNA1280个,75%位于Pol基因内。通过同源比较和保守性分析,筛选到针对Pol、M、N基因的12个siRNA(每个基因3～4个)作为后选目的片段,分别在Vero细胞、9日龄SPF鸡胚上进行基因干扰试验。结果,来自Pol、N靶序列的2个siRNA在Vero细胞上及鸡胚上均对IBV增殖产生明显的干扰作用,并与siRNA剂量有一定相关性,依赖于与mRNA互补的负链siRNA存在。本研究首次证实IBV增殖过程中存在siRNA干扰现象,为利用RNA干扰(RNAi)技术控制IBV提供了新手段。     

鸡传染性支气管炎病毒变异机制的研究进展

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB),是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变.病鸡表现为咳嗽、喷嚏、发出气管啰音.幼鸡流鼻液,蛋鸡产蛋数量和质量下降,肉鸡食欲不振,肾型病鸡肾肿大、苍白,有大量尿酸盐沉积.鸡不分年龄、性别和品种均易感,但主要侵害1～4周龄的幼鸡[1].     

Reverse Genetics System for the Avian Coronavirus Infectious Bronchitis Virus

Major advances in the study of the molecular biology of RNA viruses have resulted from the ability to generate and manipulate full-length genomic cDNAs of the viral genomes with the subsequent synthesis of infectious RNA for the generation of recombinant viruses. Coronaviruses have the largest RNA virus genomes and, together with genetic instability of some cDNA sequences in Escherichia coli, this has hampered the generation of a reverse-genetics system for this group of viruses. In this report, we describe the assembly of a full-length cDNA from the positive-sense genomic RNA of the avian coronavirus, infectious bronchitis virus (IBV), an important poultry pathogen. The IBV genomic cDNA was assembled immediately downstream of a T7 RNA polymerase promoter by in vitro ligation and cloned directly into the vaccinia virus genome. Infectious IBV RNA was generated in situ after the transfection of restricted recombinant vaccinia virus DNA into primary chick kidney cells previously infected with a recombinant fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. Recombinant IBV, containing two marker mutations, was recovered from the transfected cells. These results describe a reverse-genetics system for studying the molecular biology of IBV and establish a paradigm for generating genetically defined vaccines for IBV.     

Evolutionary implications of Avian Infectious Bronchitis Virus （AIBV） analysis

For developing efficient vaccines, it is essential to identify which amino acid changes are most important to the survival of the virus. We investigate the amino acid substitution features in the Avian Infectious Bronchitis Virus （AIBV） antigenic domain of a vaccine serotype （DE072） and a virulent viral strain （GA98） to better understand adaptive evolution of AIBV. In addition, the SARS Coronavirus （SARS-CoV） was also analyzed in the same way. It is interesting to find that extreme comparability exists between AIBV and SARS in amino acid substitution pattern. It suggests that amino acid changes that result in overall shift of residue charge and polarity should be paid special attention to during the development of vaccines.     

pH Stability Studies with Avian Infectious Bronchitis Virus (Coronavirus) Strains

A comparison of 17 infectious bronchitis virus strains, using the same test procedure and assay system, demonstrated that stability at an acid pH is a variable characteristic of the avian coronaviruses.     

鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白裂解与致病性的研究

冠状病毒的致病机理一直不清楚。对副粘病毒和正粘病毒的研究结果表明病毒的致病力与病毒纤突蛋白裂解程度有关,反过来纤突蛋白裂解程度是由纤突蛋白的连结多肽的氨基酸顺序决定的。本文试图从IBV致细胞病变作用,纤突蛋白裂解状态和连结多肽氨基酸顺序三个方面探讨IBV的致病机理。结果表明,IBV毒株在不同细胞培养(CK.CEF和Vero)中,从宿主细胞范围、致细胞病变作用和引起细胞融合几项指标表现了不同的致病力,但不同毒株从同一种细胞释放后其纤突蛋白的裂解程度无差异。连结多肽的氮基酸序列表明23株IBV的连结多肽均由5个氨基酸组成即二对碱性氨基酸Arg—Arg和Arg—Arg,中间由苯丙氨酸或丝氨酸联接。这些结果说明在致病机理方面,冠状病毒可能不同于副粘病毒和正粘病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒E蛋白基因的表达

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病是危害全球养禽业的重要传染病之一[1,2]。其感染的主要特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏?送猓?该病还可以引起蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降。雏鸡可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡。虽然疫苗的使用对IB的流行起到了一定的预防和控制作用,但由于IBV血清型众多,不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性。因此,IB目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播,给养禽业造成了严重…     

鸡传染性支气管炎病毒E蛋白基因的表达

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病.该病是危害全球养禽业的重要传染病之一[1,2].其感染的主要特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏.此外,该病还可以引起蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降.雏鸡可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡.虽然疫苗的使用对IB的流行起到了一定的预防和控制作用,但由于IBV血清型众多,不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性.因此,IB目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播,给养禽业造成了严重的经济损失.     

利用噬菌体展示肽库筛选鸡传染性支气管炎病毒模拟抗原表位

目的：利用噬菌体展示肽库技术筛选鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的模拟抗原表位。方法：用IBV阳性血清纯化IgG作为靶标。对噬菌体展示随机12肽库进行筛选，通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并对阳性克隆提取ssDNA进行测序分析。结果：3轮生物淘洗后，目标噬菌体得到125倍富集。随机挑选50个克隆进行ELISA和竞争抑制ELISA。其中有12个噬菌体克隆可以与IBV阳性血清高特异性结合。测序分析发现，这12个克隆带有2种氨基酸序列。即KSPKHSSSALHF和SFFQLNLHRPTS。且未发现这2种序列与GenBank中已发表的IBV氨基酸序列有同源性。结论：结果提示。这2个肽可能是IBV抗原的模拟表位。