膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响

膜联蛋白A2是一种参与调节多种病毒增殖的重要宿主蛋白。本研究通过构建过表达膜联蛋白A2的BHKAnxa2细胞系及瞬时敲低膜联蛋白A2,探讨膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响。通过RT-PCR从BHK-21细胞中扩增膜联蛋白A2全长cDNA,测序正确后克隆入pcDNA3.1整合表达载体中;用重组载体pcDNA3.1-Anxa2转染BHK-21细胞,经G418筛选获得抗性克隆,qRT-PCR和Western blot试验证明BHKAnxa2过表达膜联蛋白A2;EMCV感染试验证明BHK-Anxa2细胞中病毒滴度高于对照组。通过siRNA降低BHK-21细胞中膜联蛋白A2表达,EMCV感染试验证明膜联蛋白A2表达下降后EMCV增殖也随之下降。以上试验结果表明鼠膜联蛋白A2表达改变可导致病毒在BHK-21细胞中的增殖发生变化,提示膜联蛋白A2与EMCV在BHK-21细胞中的增殖相关。     

Caveolin-1在EMCV感染宿主细胞中的作用

脑心肌炎病毒(EMCV)是一种重要的人畜共患病病原,但其致病机制目前尚不明确,小窝蛋白-1(Caveolin-1)可介导多种病毒感染宿主细胞。为了探究Caveolin-1在EMCV感染宿主细胞中的作用,该实验检测了EMCV感染不同时间段He La细胞中Caveolin-1的表达量,对He La细胞和HEK-293细胞中Caveolin-1进行瞬时过表达实验、瞬时沉默实验和Caveolin-1依赖型内吞途径抑制实验,然后观察EMCV对He La细胞和HEK-293细胞的感染情况。结果发现, HeLa细胞中Caveolin-1表达量会随病毒感染时间的增加而升高;在Caveolin-1瞬时过表达实验结果中,病毒滴度、病毒拷贝数、病毒蛋白检测结果均显示,上调Caveolin-1促进EMCV感染宿主细胞, Caveolin-1瞬时沉默实验和Caveolin-1依赖型内吞途径抑制实验的结果则显示,下调Caveolin-1或抑制Caveolin-1依赖型内吞途径可抑制EMCV感染宿主细胞。上述现象提示, EMCV可通过Caveolin-1依赖型内吞途径感染宿主细胞。     

HSP27过表达抑制脑心肌炎病毒复制的作用初探

已有研究表明,HSP27在一些病毒的生命周期中发挥着重要作用,但它对于脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的调控作用尚不明晰。该研究通过构建人源HSP27的表达质粒pCMV-Myc-HSP27并于HEK293细胞中表达后,接种EMCV检测病毒的复制及相关通路蛋白表达情况。结果显示,过表达HSP27可以抑制EMCV在宿主细胞中的复制,进一步分析表明,HSP27可能是通过正调控IFN-β信号通路中接头分子MAVS、TBK1、IRF3的表达和阻止自噬体与溶酶体的融合实现对EMCV复制的负调控作用。总之,该研究首次表明,HSP27抑制EMCV复制是通过IFN-β信号通路及自噬途径来实现的,这些发现为揭示EMCV感染中宿主因子的调控作用和潜在的抗病毒靶点提供新的见解。     

TRIM家族蛋白在病毒感染中作用的研究进展

三基序蛋白家族(tripartite motif,TRIM)是参与不同细胞功能的一大类具有E3泛素连接酶活性的蛋白质，在宿主抗病毒免疫应答中发挥着重要的作用。TRIM家族蛋白可通过提高宿主固有免疫应答或直接降解病毒蛋白发挥抗病毒活性；部分病毒有时也可利用TRIM家族蛋白调控细胞因子表达促进自身感染。本文综述了TRIM家族蛋白在病毒复制中的作用及相关机制的研究进展，为研究病毒感染机制提供参考。     

通过基因组定量研究猪瘟病毒在细胞中的增殖特性

应用间接免疫荧光、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)测定技术,分别从病毒抗原、病毒基因组RNA复制水平和病毒感染滴度变化3个方面,研究了猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞中增殖的特点,用猪瘟病毒石门株感染96孔板培养的细胞,1×102个TCID50/孔,间接免疫荧光检测结果显示感染后8h能检测到被荧光抗体染色的感染细胞,随感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,在感染后72h,几乎所有细胞均能出现荧光。Real-time PCR结果显示在细胞感染初期的8~24h,病毒的基因组RNA复制呈加速趋势,其拷贝数在感染后72h达到高峰。此外,在感染后8h能检测到病毒基因组负链RNA转录,不过负链RNA在病毒增殖过程中维持在较低的水平。TCID50测定结果表明CSFV的感染滴度增加趋势与基因组类似,在病毒感染8h后能检测到具有感染性的子代病毒,感染滴度在8~20h之间逐渐增长,24~48h之间增长速度稍减慢,在感染后48~52h达到高峰,能在72h之内维持较高的感染滴度。     

靶向VEGF小干扰RNA协同5-FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡机制的研究

探讨慢病毒介导的靶向VEGF小干扰RNA联合应用化疗药物5 FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制。以携带VEGF siRNA的慢病毒载体感染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组VEGF mRNA、VEGF蛋白及凋亡相关蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,慢病毒VEGF siRNA干扰组细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,凋亡相关蛋白P53及P21表达上调,而SIRT1、Bcl-2及Survivin表达下调。流式细胞术检测显示慢病毒干扰组及5-FU组细胞凋亡率显著升高,联合治疗组的协同作用更为明显。上述结果表明：慢病毒介导的RNA干扰能明显抑制MCF-7细胞VEGF的表达,通过下调SIRTI蛋白的表达,导致P53蛋白表达上调,并调控其下游P21、bcl-2和Survivin的表达,从而诱导MCF-7细胞的凋亡,并且提高了MCF-7对5-FU的敏感性。     

FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。     

特异性干扰PB-1基因对H5N1高致病性禽流感病毒复制的影响

针对H5N1高致病性禽流感病毒PB-1基因,通过RNA干扰技术,设计siRNA,研究其抑制病毒复制的效果.siRNA转染MDCK细胞并接毒后,病毒滴度测定、Real-time PCR和间接免疫荧光试验结果显示,所设计的siRNA(ps-PB1-777)具有明显的抑制病毒复制的效果,PB-1基因的拷贝数和病毒蛋白表达都下降.设计的siRNA可显著抑制高致病性禽流感病毒的复制.因此,本研究中PB-1基因的有效siRNA可为预防和治疗H5N1高致病性禽流感提供合理的技术支持和物质储备.     

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖

本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的干扰作用。筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究。成功观测到由载体表达的小干扰RNA(siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象。通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据。证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖。实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路。     

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖

本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV) 增殖的干扰作用.筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究.成功观测到由载体表达的小干扰RNA (siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象.通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据.证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖.实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路.     

敲低TRAF6对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制

该文探讨了干扰肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)表达对人白血病K562细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制。将靶向TRAF6基因的sh RNA慢病毒载体感染K562细胞,利用荧光显微镜观察感染效率;Western blot方法检测TRAF6蛋白表达的改变;CCK-8法检测体外细胞增殖活性;流式细胞术分析细胞凋亡率;Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达和AKT磷酸化水平的变化。结果显示,TRAF6-sh RNA慢病毒载体成功感染K562细胞,TRAF6蛋白表达水平明显下降。与空白对照组和TRAF6-NC组相比较,TRAF6-sh RNA组细胞增殖能力明显受抑(P0.05),而细胞凋亡率增加(P0.05);同时,促凋亡蛋白Bax表达升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降。此外,干扰TRAF6可下调K562细胞p-AKT(T308)和p-AKT(S473)活性,而总AKT水平未见明显变化。该研究表明,干扰TRAF6表达可抑制K562细胞增殖和诱导细胞凋亡,其机制可能与下调AKT活性有关,提示TRAF6可作为白血病治疗的一个潜在靶点。     

表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组脑心肌炎病毒的构建与鉴定

以脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)作为病毒载体,寻找基因组里理想的外源基因插入位点,为构建多价疫苗奠定基础。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病。脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主谱广,能够天然感染多种哺乳动物。本研究采用EMCV NJ08毒株cDNA感染性克隆,将PCV2ORF2基因插入EMCV L蛋白基因第6位及第7位氨基酸之间,拯救获得重组EMCV rNJ08/Cap,拯救病毒含有分子遗传标记。Western Blot和IFA结果显示,该重组病毒成功表达Cap蛋白。重组病毒rNJ08/Cap在BHK-21细胞上生长曲线和病毒蚀斑大小与亲本病毒NJ08相似,证明EMCV可以作为表达外源基因的病毒载体,为PCV2和EMCV疫苗研究奠定了重要基础。     

神经胶质瘤细胞ATF5表达水平对HCMV复制的影响

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在神经胶质瘤细胞中的复制水平不一,其机制尚不清楚。本研究通过下调转录激活因子5(ATF5)在神经胶质瘤细胞中的表达,检测HCMV感染神经胶质瘤细胞后病毒复制水平的变化。首先用HCMV AD169(MOI=5)分别感染U87、SY5Y及A172细胞,观察细胞形态变化,分别在24、48、72、96、120 h取各时间点上清液检测病毒滴度;Real-time PCR检测HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表达情况;Western-blot检测病毒基因编码蛋白及ATF5表达的情况。结果显示HCMV在U87、SY5Y细胞中复制水平与病毒在A172细胞中复制水平相比,U87、SY5Y细胞组明显高于A172细胞组(P0.05),ATF5表达在U87、SY5Y细胞组与A172细胞组相比,U87、SY5Y细胞组ATF5表达明显高于A172组(P0.05);利用慢病毒介导的RNA干扰技术下调ATF5在U87、SY5Y细胞的表达,用HCMV感染细胞检测病毒基因及蛋白的表达,结果ATF5表达下调可抑制HCMV的复制(P0.05)。以上结果表明,在胶质瘤细胞中下调ATF5表达水平可以抑制HCMV的复制水平。     

下调细胞P21WAF1/CIP1基因表达可抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型复制

为了揭示细胞P21蛋白在单纯疱疹病毒Ⅱ型（herpes simplex virus type 2, HSV-2）复制中的作用,通过用HSV-2感染和感染前用特异性小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA) 抑制P21基因表达,应用Western 印迹方法检测宿主细胞和病毒蛋白水平,用终点滴定法测定病毒半数组织培养感染量（50% tissue culture infectious dose, TCID50）,以及观察感染细胞的细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）等3个方面,揭示细胞P21蛋白水平的变化对病毒复制的影响.结果表明,HSV-2在细胞内复制时可引起P21蛋白水平增高;而用特异性siRNA下调细胞P21基因表达时,可显著地抑制HSV-2 gB蛋白水平,减少培养细胞上清液中病毒TCID50.提示P21蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.     

TRBP2基因过表达对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制

该文探讨了TAR RNA结合蛋白2(TAR RNA binding protein 2,TRBP2)基因对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制。构建TRBP2慢病毒过表达载体,以不同感染复数(MOI)感染A549细胞,根据绿色荧光强度选择最适MOI值。荧光定量PCR(FQ-PCR)检测TRBP2、MMP-2(matrix metalloproteinase-2)、PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase)m RNA的表达量。免疫蛋白印记(Western blot)法检测TRBP2、MMP-2、PKR、p-PKR的表达。采用MTT法、平板克隆实验检测TRBP2基因对A549细胞增殖的影响,Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,黏附实验检测同种细胞和异种细胞间黏附情况。结果发现,成功构建了TRBP2基因过表达的A549细胞株,与空载体组和对照组比较,TRBP2基因过表达组细胞侵袭、迁移能力明显增强(P0.05),同种细胞间黏附力减弱(P0.05)而异种细胞间黏附力增强(P0.05),增殖速度加快(P0.05)及克隆形成率增加(P0.05)。此外,MMP-2、TRBP2蛋白及m RNA表达量明显升高(P0.05);p-PKR蛋白表达量降低(P0.05);PKR蛋白及m RNA表达量无差异。对照组与空载体组之间比较,以上各项指标均没有明显差异(P0.05)。该研究表明,过表达TRBP2基因可能通过促进MMP-2的表达同时抑制PKR磷酸化来促进肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF2～4特异siRNA的筛选及其抑制病毒复制效果的研究

RNA干扰（RNAi）技术是基因功能研究的有效工具,为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用,针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA（siRNA）位点（共12个）,构建相应的短发夹RNA（shRNA）表达载体,转染MARC-145细胞后,通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体,病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量,细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184～4.65倍。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF2～4特异siRNA的筛选及其抑制病毒复制效果的研究

RNA干扰(RNAi)技术是基因功能研究的有效工具,为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用,针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA(siRNA)位点(共12个),构建相应的短发夹RNA(shRNA)表达载体,转染MARC-145细胞后,通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体,病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量,细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184~4.65倍。     

干扰素刺激基因IFIT1抑制蓝舌病病毒的复制

为了研究干扰素刺激基因1(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,IFIT1)在蓝舌病病毒1型（Bluetongue virus serotype 1,BTV1）感染复制过程中的作用，首先利用实时定量PCR检测到BTV1感染绵羊睾丸细胞后IFIT1基因的转录水平明显升高，利用RT-PCR方法扩增获得羊IFIT1基因，测序后进行生物信息学分析，将其克隆到质粒载体pcDNA3.1/（+）上，构建重组表达质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1，将其转染BHK-21细胞，观察到IFIT1基因在细胞内的成功表达，然后利用BTV1感染质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1转染的细胞，从病毒的mRNA转录、蛋白表达和病毒滴度的变化评价IFIT1对BTV1复制的影响。结果显示，IFIT1在细胞中的过表达可显著抑制BTV1复制，相反，敲低IFIT1的表达可促进BTV1的复制。本研究首次报道了干扰素刺激基因IFIT1在BTV1感染复制过程中的作用，这将有助于揭示BTV1和宿主细胞IFIT1的相互作用机制，同时也为抗病毒药物研发...