凡纳滨对虾TCP-1-eta基因的克隆及与耐寒性状的相关性

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理,文章克隆了凡纳滨对虾的耐寒相关基因TCP-1-eta并对其与耐寒性状的关系进行了研究。首先,根据电子克隆所得序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到长1 705 bp的TCP-1-eta基因序列,其中包括1 629 bp的完整开放阅读框,编码542个氨基酸残基。然后,运用荧光定量PCR对TCP-1-eta基因进行时空表达谱的分析:(1)组织表达分析结果显示,该基因在凡纳滨对虾肌肉组织中表达量最高;(2)不同低温处理下的表达结果显示,该基因在15℃开始呈上调表达,13℃时表达量最高;(3)13℃低温处理的表达结果显示,该基因在36 h内呈小幅上调表达,但36 h后表达量显著升高,48 h表达量达到0 h的150倍。进一步采用PCR-RFLP方法对216只凡纳滨对虾TCP-1-eta基因进行了SNP多态性检测,并将其与耐寒性状进行了关联分析。在该基因编码区第731碱基上发现C/T突变,方差分析结果表明该位点的不同基因型与耐寒力指标CDH(Cooling-degree hours)值相关(P<0.05),其中CC基因型的耐寒能力比TT基因型强。     

凡纳滨对虾ANT2 基因的克隆及低温表达谱分析

为研究凡纳滨对虾适应低温的分子机理, 实验对从低温处理凡纳滨对虾抑制性消减文库中筛选出的一个360 bp EST 序列进行了研究。首先, 同源比对显示该EST 片段与其他物种的ANT2 基因高度同源, 命名为凡纳滨对虾ANT2 基因(LVANT2); 其次, 通过构建凡纳滨对虾肝胰腺全长cDNA 文库, PCR 扩增获得LVANT2 基因的全长cDNA1540 bp, 其中包括1011 bp 的完整开放阅读框, 编码336 个氨基酸残基。然后, 对基因进行了不同组织和低温处理的表达谱分析: (1)组织表达谱的结果显示, 该基因在凡纳滨对虾肌肉组织中表达量最高; (2)在不同低温处理下的表达结果显示, 该基因在15℃处理下基因表达量发生显著变化, 13℃开始呈下调表达, 11℃时表达量又升高; 13℃低温处理不同时间发现该基因在12h 内表达量发生显著变化,48h 后表达量最高。LVANT2 基因的低温诱导表达模式说明其可能在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用       

低温诱导型凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆与表达分析

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子基础, 克隆鉴定了凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶的同源基因。根据差减文库中筛选到的一个低温上调表达的DEAD-box RNA解旋酶基因片段, 通过RACE PCR扩增获得两条高度相似的cDNA全长序列, 两条cDNA均为1430 bp, 包含139 bp 5'UTR、79 bp 3'UTR和1212 bp 开放阅读框, 编码403个氨基酸残基。Blast比对结果显示, 两条cDNA与其他物种的DDX5相似性最高, 推测为凡纳滨对虾DDX5基因的两个变异体, 分别命名为LvDDX5variant A (LvDDX5A)和LvDDX5variant B (LvDDX5B), 在系统进化树中, LvDDX5A和LvDDX5B聚为最近的一支, 并与虾类DDX5、文昌鱼DDX、贝类的DDX5距离较近。Real-time PCR分析结果显示, LvDDX5A和LvDDX5B都呈多组织遍在表达, 在精巢、鳃、肠、肌肉和卵巢中,LvDDX5B表达量高于LvDDX5A, 而在肝胰腺中LvDDX5A表达量高于LvDDX5B。在低温胁迫对虾肝胰腺和心中, LvDDX5A呈上调表达而LvDDX5B表达量无明显变化。进一步对LvDDX5A在不同低温条件胁迫对虾的肝胰腺中表达变化进行了分析。结果显示, LvDDX5A在18℃、15℃、13℃和11℃低温胁迫36h均被诱导表达,并随着15℃和13℃低温胁迫时间的增加呈先上升后下降的表达模式, 在48h达到峰值, LvDDX5A的低温诱导表达模式暗示其可能是在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用的剪接体。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)盐度调控相关基因CLCA1的克隆及表达分析

钙激活氯离子通道调节剂(calcium-activated chloride channel regulator,CLCA)为一类金属蛋白酶依赖家族,在哺乳动物上皮组织杯状细胞的粘液产生和粘液平衡中起重要作用.为了探究CLCA1基因在凡纳滨对虾渗透压中的作用机制,本研究采用RACE技术在凡纳滨对虾中克隆出了CLCA1基因,该基因总长度为3129 bp,5'端非编码区长度为175 bp,3'端非编码区长度为107 bp,开放阅读框ORF长度为2847 bp,共编码984个氨基酸,有1个跨膜区域,膜外有VMA结构域.与其他物种氨基酸序列比对结果显示,凡纳滨对虾CLCA1氨基酸与其他物种相似性都较低,相似度最高的为刀额新对虾(Procambarus clarkii) CLCA2氨基酸序列,为47.83％.RT-qPCR结果显示,CLCA1基因在凡纳滨对虾各组织中均有表达,其中肠道、肝胰腺和鳃中的表达量较高;对不同盐度下凡纳滨对虾4个组织中CLCA1基因的定量结果显示,随着盐度的下降,CLCA1基因的表达量在4个组织中呈下调趋势,表明CLCA1基因与凡纳滨对虾的渗透压调节相关.本研究初步阐明了CLCA1基因的理化性质,对CLCA1基因在凡纳滨对虾体内各组织和不同盐度下各组织的表达定量可为CLCA1基因在今后甲壳动物的渗透压调节及免疫调节的研究提供基础支持.     

尼罗罗非鱼TCP-1-beta和TCP-1-eta的分子特征及其低温诱导表达

为了研究尼罗罗非鱼耐寒性状的分子基础并为耐寒品种选育提供参考,研究从尼罗罗非鱼中克隆了HSP60家族TCP-1-beta和TCP-1-eta基因并对其在低温诱导下的表达特征进行了分析。尼罗罗非鱼TCP-1-beta cDNA长度为1755 bp,包括1605 bp的完整开放阅读框,编码534个氨基酸;尼罗罗非鱼TCP-1-eta cDNA长度1651 bp,包括1638 bp的完整开放阅读框,编码545个氨基酸。与其他物种同源基因的蛋白序列比对结果显示,TCP-1-beta和TCP-1-eta蛋白在物种间同源性很高,且都具有保守的ATP结合结构域等,预示其在物种间功能的保守性。实时荧光定量PCR结果表明:TCP-1-beta和TCP-1-eta在各组织中呈遍在表达,但在肌肉中表达量最高;诱导温度从22℃降至12℃,不同低温诱导48h后TCP-1-beta和TCP-1-eta均呈上调表达,在18℃时表达开始上调,随着低温胁迫程度加强,表达上调幅度增大,至12℃时表达量达到最高,TCP-1-beta和TCP-1-eta上调幅度分别达到常温的12.2倍和10.7倍。这些结果预示在尼罗罗非鱼中,TCP-1-beta和TCP-1-eta是潜在的耐寒相关基因。     

凡纳滨对虾MT基因序列及其在卵巢发育和低温胁迫中的表达分析

在低温处理仔虾全长cDNA文库的筛选测序中, 获得凡纳滨对虾(Litopenaeus vannmei)金属硫蛋白基因全长cDNA序列, 该序列含有425个碱基, 包含177 bp开放阅读框, 上游98 bp的非编码区及下游150 bp 的非编码区, 编码58个氨基酸, 其中半胱氨酸含量丰富, 富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys 结构。多序列比对表明, 凡纳滨对虾MT蛋白序列与美洲螯龙虾(Homarus americanus)MT蛋白序列具最高同源性72.4%。Real-time PCR结果表明, 凡纳滨对虾MT基因在卵巢组织中呈优势表达, 在不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 在低温处理凡纳滨对虾肝胰腺组织中上调表达。实验所得结果为研究凡纳滨对虾金属硫蛋白基因在生殖发育和低温应激中的功能提供了参考。       

凡纳滨对虾DNaseⅠ基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中克隆了DNaseⅠ基因的全长cDNA序列。该序列全长1614bp,包含1209bp的开放阅读框,编码一个含403个氨基酸的蛋白;5′非翻译区为116bp,3′非翻译区为289bp。实时定量PCR分析结果表明,DNaseⅠ基因在肝胰腺的表达量是其他器官表达量的16～162倍,表明凡纳滨对虾DNaseⅠ基因属于胰腺型表达。本研究还利用酶切重组构建原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达出了有活性的重组DNaseⅠ蛋白。     

凡纳滨对虾低温差异表达miRNA的分析鉴定及靶基因的验证

为了解析miRNA及靶基因在凡纳滨对虾低温适应过程中的分子调控机制, 研究开展了凡纳滨对虾常温(28℃)及低温锻炼(16℃, 6d)下肝胰腺小RNA文库的测序和分析。从常温对虾的小RNA文库测序获得18—32 nt的高质量序列10690259条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 57条; 而从低温锻炼对虾的小RNA文库获得18—32 nt的高质量序列序列8587144条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 48条。分析获得25个在低温锻炼下呈显著差异表达的miRNAs。运用qRT-PCR验证了3条低温下差异极显著的miRNAs的表达模式。结果显示, 3条miRNAs的表达模式与高通量测序结果基本一致。预测低温差异表达miRNAs的靶基因, 并与转录组分析获得的低温显著差异表达基因进行比对, 从二者重合的基因集中挑选出4个基因, 即nuclear export mediator factor Nemf-lik、synapse-associated protein、seleno proteins 以及DEAD-box RNA helicase Variant 1, 运用qRT-PCR验证其在不同条件低温锻炼凡纳滨对虾肝胰腺中的表达规律, 为解析miRNAs及其靶基因在对虾低温适应过程中的分子调控机制提供了基础数据。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Wnt9α基因的克隆与表达分析

Wnt信号通路已被证实在细胞增殖分化、胚胎发育等多方面起重要作用,Wnt基因家族是重要的调节因子。为了了解更多的无脊椎动物Wnt基因相关的信息,本研究首次克隆并鉴定了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中的Wnt9α基因,命名为Lv Wnt9α,其基因全长c DNA为1 845 bp,包含长度为1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码460个氨基酸,包括一个信号肽和一个Wnt1结构域。实时荧光定量PCR(RT-PCR)分析表明Lv Wnt9α在被检测的所有组织中都有表达,其中在眼柄、肝胰腺、后盲囊、胃的表达量较高。白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)感染后,凡纳滨对虾血液中Lv Wnt9α基因的表达量呈先上升后下降趋势,在感染后48 h达到最高。革兰氏阴性菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染后,凡纳滨对虾血细胞中Lv Wnt9α基因表达量均在24 h达到最高水平,分别为对照组表达量的6.8倍和6.2倍。所有实验结果表明,Lv Wnt9α基因可能参与凡纳滨对虾先天性免疫应答途径。     

凡纳滨对虾β-actin基因的克隆与表达

目的:克隆凡纳滨对虾肌动蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法:根据GenBank上凡纳滨对虾β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从凡纳滨对虾肌肉组织中克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,克隆序列连接到pBAD/gⅢA质粒,转化人大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,进行温度诱导表达重组蛋白.结果:克隆序列长度为1300bp,测序结果与Gene-Bank序列同源性达99.91%;获得重组体诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在约48kD处有表达的蛋白带,表达产物经Western Blotting鉴定为阳性.结论:获得β-actin基因在大肠杆菌中稳定表达产物.