PIG7基因与Litaf／Simple蛋白

PIG7基因是与p53诱导凋亡密切相关的基因,与代谢、炎症、肿瘤等关系紧密。该基因可能存在2种不同的转录本——Litaf与Simple,Litaf在LPS诱导TNF-α表达过程中起转录激活作用,Simple可能参与溶酶体介导的细胞内蛋白分选和降解过程。     

聚合度7-15的壳寡糖抑制脂多糖刺激的单核细胞产生TNF-α和IL-8的作用研究

本文通过建立脂多糖刺激的单核细胞炎症损伤模型,观察聚合度7-15的壳寡糖对炎性单核细胞白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响,及对p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)信号通路磷酸化的影响。采用p38信号通路抑制剂(SB203580)验证抑制p38信号通路对脂多糖诱导的单核细胞表达IL-8和TNF-α的作用,从而探索壳寡糖抑制单核细胞炎性损伤的分子机制。结果表明壳寡糖可抑制脂多糖诱导的单核细胞表达IL-8和TNF-α,并且抑制p38信号蛋白的磷酸化水平。因此,初步认为壳寡糖可能通过抑制炎性U937细胞中p38MAPK信号通路抑制IL-8和TNF-α的表达。     

核盘菌AROM蛋白的三级结构分析

核盘菌编码AROM蛋白的arom基因已经被克隆测序,本文根据该基因翻译的氨基酸序列用同源模建方法和从头模建方法分析了AROM蛋白各结构域的三级结构和功能位点,以及该蛋白二聚体可能的组装方式。结果表明,核盘菌AROM蛋白的脱氢奎尼酸合酶结构域进一步由N-端含有一个Rossmann折叠的α/β结构域和C-端的α螺旋结构域组成;5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶结构域则由两个相似结构域组成,每个结构域含有不同拷贝数的β折叠和α螺旋;莽草酸激酶结构域的N-端由三个β折叠组成;脱氢奎尼酸酶结构域为(α2β2)3多肽,在N-端有一对反平行的β链,在C-端有loop环;莽草酸脱氢酶结构域含有一个由α/β组成的催化结构域和一个含有Rossmann折叠的NADPH结合结构域。     

抑癌基因p53蛋白产物与DNA相互作用的研究进展

抑癌基因p53蛋白产物是一种多功能的转录调控因子,其C-末端含DNA结合区,N-末端含转录激活区。它能通过磷酸化或构象变化来激活其DNA结合活性,从而与某些基因的启动子区结合而激活它们的转录,而对不具有与其结合位点基因的转录起抑制作用。p53蛋白还能作为一种DNA复制因子,通过与某些基因的复制起始区结合而对它们的复制或修复进行调控。对基因转录或复制的调控都最终反映在对细胞周期的调控上。     

虾夷扇贝脂多糖诱导的肿瘤坏死因子LITAF基因的克隆及表达分析

脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)是一类重要的炎症细胞因子,在先天性免疫系统中发挥重要的介质作用。文章根据虾夷扇贝LITAF基因EST序列,应用RACE技术克隆了虾夷扇贝LITAF全长cDNA,对序列及编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,该基因cDNA全长1 551 bp,其5′非编码区包含76 bp,3′非编码区包含1 001 bp;开放阅读框(ORF)为474 bp,编码157个氨基酸,氨基酸序列中存在一个保守的LITAF结构域;理论分子量16.99 kDa,等电点为6.24。LITAF基因序列为3 698 bp,由3个外显子和两个内含子组成。利用实时荧光定量PCR技术分析LITAF在虾夷扇贝不同组织、不同胚胎发育阶段以及鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后各时间段的表达情况。结果表明:LITAF基因在所检测的6个成体组织中均有表达,其中肾脏的表达量最高;胚胎发育的7个时期中,担轮幼体时期表达量最高;菌刺激36 h实验组与对照组的表达量差异大。LITAF基因是LITAF家族的一员,推测LITAF基因参与虾夷扇贝的先天性免疫反应。     

泛素化在TRAF2介导的NF-κB信号通路中的作用

NF-κB（核因子κ增强子结合蛋白）是核转录因子家族成员,具有调节免疫、炎症和细胞存活的功能.它可被TRAF2（tumor necrosis factor receptor associated factor 2,肿瘤坏死因子受体相关因子2）等相关因子活化.TRAF2包含了N-端的环指结构域和C-端的高度保守结构域.它通过与肿瘤坏死因子受体超家族成员相互作用,介导了下游信号通路.而TRAF2的泛素化在过程中是关键的,鞘磷脂作为TRAF2的泛素化连接酶辅助因子,在TRAF2介导的NF-κB信号通路中发挥重要作用.     

Purα蛋白质不同结构域对APP基因表达的调控作用

该研究将构建的含淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒与Purα全长基因或含不同结构域的Purα缺失突变体共转染到U87MG细胞中,进行萤火虫荧光素酶活性测定,以确定Purα对APP基因表达的调控作用。同时,将Purα全长基因及含有不同结构域的Purα缺失突变体的真核表达载体分别转染至U87MG细胞,使目的蛋白过表达,通过实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)研究Purα不同的结构域对APP基因在转录、翻译水平的调控作用。结果显示,Purα全长蛋白及其不同结构域对APP基因表达均有不同程度的抑制作用,但至少保持N-端或C-端的结构域可能是维持Purα蛋白功能的必要条件。     

牛杀菌/通透性增加蛋白对脂多糖介导的炎性细胞因子表达的影响

杀菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)能结合并特异地中和来自革兰氏阴性菌外膜的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。为了研究牛源BPI蛋白及其N端结构域在LPS介导的免疫应答中的作用,本文将BPI全长1 449 bp编码区序列(BPI)和其N端714 bp的编码区序列(BPI714)分别导入m HEK293细胞,分析了稳定表达的BPI或BPI714对LPS介导的炎性细胞因子表达的影响。首先将构建的p LEX-BPI/p LEX-BPI714载体分别转染m HEK293细胞,获得稳定表达牛源BPI或BPI714的m HEK293细胞;然后用LPS刺激上述细胞,分别收集刺激前、刺激后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h的细胞,并同时收集未表达BPI或BPI714的m HEK293细胞在各时间点的样品作为对照;采用定量RT-PCR检测上述细胞中炎性细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB-1、NF-κB-2的相对表达水平,比较LPS刺激前后表达BPI/BPI714和对照细胞中上述基因转录水平的变化规律。研究表明,LPS刺激后,对照细胞中IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB-2表达水平在不同时间点均显著提高(P0.05),并呈现规律性变化;而稳定表达BPI/BPI714的细胞在同样刺激条件下,IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB-2基因的转录水平均未发生显著变化(P0.05)。根据我们的实验结果,在m HKE293细胞模型中BPI或BPI714均能显著降低LPS介导的炎性细胞因子表达,抑制LPS介导的免疫应答。这不仅为进一步研究BPI抑菌机制和利用其抑菌功能提供了可靠的实验依据,也为分析抗菌蛋白的抗菌效果提供了一种可靠的实验方法。     

非生物逆境胁迫相关NAC转录因子的生物信息学分析

通过生物信息学手段,对22种NAC蛋白(14种非生物逆境胁迫相关NAC蛋白、8种涉及不同生物学功能的NAC蛋白)进行氨基酸序列比对和系统发生树构建,对14种非生物逆境胁迫相关NAC蛋白氨基酸组成、理化性质、亲/疏水性、保守结构域、亚细胞定位、二级结构及三级结构等进行了分析、预测。结果显示,22个NAC蛋白中,非生物逆境相关的NAC蛋白聚成一类,其余NAC蛋白聚为另一类;非生物逆境胁迫相关的NAC蛋白序列分析显示,N-端具有A、B、C、D、E 5个保守的亚结构域,共同组成NAC结构域,C-端含有多个保守的酸性氨基酸位点,具有转录激活功能,同时蛋白中含有多个丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)磷酸化位点;非生物逆境胁迫相关NAC蛋白主要亲水区域位于A、C、D亚域,大多定位于细胞核,个别定位于细胞质或线粒体,二级结构则以α-螺旋和β-折叠片为主;拟南芥RD26和ANAC三级结构上的一致性暗示了功能上的相似。     

黄芩苷对脂多糖诱导的巨噬细胞NF-κB活化和炎症因子表达的影响

目的:研究黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表达的影响.方法:分别用LPS(终浓度1μgomL-1)和LPs+黄芩苷(终浓度10,50,100μmol moloL-1)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,用RT-PCR法和Elisa法检测细胞及其上清液中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达变化,用Western Blot法检测细胞核内NF-κB p65蛋白含量变化.结果:LPS刺激RAW264.7细胞可导致NF-κB激活,上调TNF-α、IL-6表达;黄芩苷预处理能降低LPS诱导的NF-κB出活化和TNF-α、IL-6表达.结论:黄芩苷可通过抑制NF-κB活化,下调LPS诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-6的生成,发挥抗炎作用.这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一.     

银杏叶提取物对内毒素诱导巨噬细胞核因子-κB活化及炎性细胞因子表达的调节

探讨银杏叶提取物（EGb761）对内毒素（LPS）诱导RAW264．7细胞核因子-κB（NF-κB）活化及炎性细胞因子基因表达的调节,为银杏叶提取物的临床运用提供理论依据．分别用LPS或EGb761＋LPS处理体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞,采用蛋白质印迹分析检测细胞中NF-κB活性,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA和蛋白的表达．研究结果表明LPS组NF-κB活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量在刺激后2～12h明显高于正常对照组,而EGb761＋LPS组NF-κB活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著低于LPS组．结果提示LPS可诱导RAW264．7细胞NF-κB活化,导致TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增强,而EGb761能抑制NF-κB活化而调节TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表达．     

乳酸调控大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的NF-κB信号通路

目的探讨内毒素（LPS）刺激大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMMVECs）后,乳酸（LA）调控NF-κB信号通路中磷酸化IκBα和NF-κB p65蛋白表达情况,肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）mRNA表达情况,阐明乳酸发挥作用的最佳时间及其调控NF-κB信号通路的部位。方法提取RIMMVECs总蛋白和总RNA,用Western blotting检测NF-κB p65、IκBα及p-IκBα蛋白表达水平,用real-time PCR对TNF-α和IL-6 mRNA进行定量检测。结果乳酸能降低LPS诱导RIMMVECs分泌的TNF-α和IL-6 mRNA表达水平,并分别于24 h和3 h下调效果最明显;乳酸能抑制IκBα磷酸化及NF-κB转录活性,并于4～8 h达到最佳效果;乳酸发挥作用部位是抑制信号通路中IκBα磷酸化。结论乳酸通过抑制IκBα磷酸化而阻断NF-κB的激活,抑制下游炎性因子表达,进而发挥出很好的预防炎症效果。     

正常人SC细胞株分化的M1型巨噬细胞模型表征

该文以佛波酯诱导正常人单核细胞来源的SC细胞建立SC-巨噬细胞模型,并表征其形态、吞噬作用、表面标志物和炎症细胞因子分泌情况,评价SC-巨噬细胞模型是否具有典型M1型巨噬细胞表型。结果表明, SC-巨噬细胞贴壁生长,形态以圆形或椭圆形为主;具有caveolae介导的吞噬荧光微球的能力,表面标志物CD11b和LPS受体CD14较SC细胞均显著上调。加入LPS后, SC-巨噬细胞大部分呈长梭形或纺锤形,有明显的伪足,巨噬细胞成熟标志物CD80和CD86均表达上调,炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的分泌水平均显著上调,这些细胞因子的mRNA转录水平也有上调趋势。SC-巨噬细胞具有正常M1型巨噬细胞的表型特征,该研究的结论支持SC-巨噬细胞模型更为广泛地应用于科研。     

连翘脂素对LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应的影响

为研究连翘脂素的抗炎效应及其抗炎机制,以地塞米松作为阳性对照,建立脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,检测炎症因子的释放及相关蛋白和mRNA的表达,以期提高对连翘脂素抗炎作用的全面认识并为连翘脂素临床开发提供有力的科学依据。实验采用Griess法检测细胞上清液中NO含量,ELISA法检测TNF-α和IL-6的含量,Westernblot法检测iNOS、COX-2蛋白的表达,RT-qPCR法检测iNOS、COX-2mRNA的表达。与LPS组比较,连翘脂素组和地塞米松组可以明显降低LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6的量,并呈现浓度依赖关系。Westrenblot和RT-qPCR结果显示连翘脂素能抑制LPS诱导的iNOS、COX-2的蛋白表达以及mRNA的表达,并呈浓度依赖关系。实验研究表明连翘脂素能够明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的释放,iNOS、COX-2蛋白及mRNA的表达从而抑制炎症反应。     

细菌脂多糖诱导人单核细胞株对细菌脂蛋白的耐受性及其与肌动蛋白骨架关系

细菌脂多糖(LPS)可诱导宿主对LPS的耐受,但对细菌脂蛋白(BLP)是否存在交叉耐受,目前报道不一。采用人单核细胞株(THP-1),建立小剂量LPS诱导THP-1对LPS耐受的细胞模型;观察细胞肌动蛋白骨架、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度及NF-κB的DNA结合活力的变化情况;探讨BLP交叉耐受及细胞骨架在其中的作用。结果显示,THP-1细胞经小剂量(10ng/ml)LPS、大剂量(100ng/ml)LPS或BLP刺激后,细胞形态严重变形,肌动蛋白重组,细胞周边肌动蛋白丝带消失,出现明显的肌动蛋白收缩团块及伪足,细胞核内NF-κB的DNA结合活性显著升高,培养上清液中炎症因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)的释放显著增加;而小剂量LPS预刺激12h后,再用大剂量的LPS或BLP刺激6h,上述指标明显改善;采用细胞骨架肌动蛋白聚集破坏剂鬼笔环肽预处理后的THP-1细胞,可取消由小剂量LPS诱导的自身耐受及对BLP的交叉耐受;可见,细菌LPS、BLP(100ng/ml)可诱导THP-1细胞肌动蛋白骨架的改变,激活NF-κB信号通路,诱导炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6过度释放,激活宿主炎症细胞的炎症反应;而小剂量LPS预刺激后可诱导出THP-1细胞对LPS的自身耐受和对BLP的交叉耐受;细胞骨架肌动蛋白参与了小剂量LPS诱导THP-1细胞对LPS自身耐受和对BLP交叉耐受的形成。     

P38在LPS诱导大鼠雪旺氏(Schwann) 细胞TNF-α表达中的作用

应用免疫荧光标记、基因转染等方法,观察脂多糖（LPS）刺激对单核细胞系Raw264.7细胞骨架的影响,探讨p38家族不同亚型对LPS诱导的细胞骨架蛋白微管蛋白与肌动蛋白变化的调控作用结果显示,未受LPS刺激的细胞富含微管蛋白,微管蛋白交联形成辐射状的交联丝网,丝网在细胞中分布均匀;LPS刺激后,微管蛋白募集在细胞膜、核膜周围;p38α、p38β、p38γ亚型的特异性抑制剂FHPI对LPS诱导的微管蛋白募集无影响,而p38无活性突变体p38δ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞骨架微管蛋白的募集;肌动蛋白在静息的细胞内主要存在于细胞膜周围,LPS作用后,肌动蛋白在细胞中形成广泛分布的辐射状应激纤维;p38上游激酶活性诱变体MKK6b基因转染可诱导Raw细胞形成类似的应激纤维,而p38γ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞应激纤维的形成.上述结果表明,p38δ可能参与了LPS诱导的微管蛋白的重构;而LPS诱导Raw细胞应激纤维的形成,可能是通过p38γ蛋白激酶而发挥作用.     

亚硝基化谷胱甘肽还原酶: 一个调控炎症反应的新分子

炎症因子的表达调控是炎症反应的关键步骤,与自身免疫疾病以及癌症等密切相关．一氧化氮(nitric oxide,NO)在炎症因子表达调控中具有重要作用,但已有的研究多关注于NO合成对炎症因子的调控作用,而对NO代谢的作用知之甚少．亚硝基化谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)是体内NO信号通路代谢调控的关键蛋白．本研究发现脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在RAW264.7细胞中上调诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的同时下调GSNOR的转录和蛋白质表达,该下调作用依赖MEK1/2、p38和PI3K信号通路．抑制GSNOR可促进LPS诱导的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达,而过表达GSNOR作用相反．抗炎症药物曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA)能够挽回LPS对GSNOR的下调作用,并且GSNOR抑制剂削弱了TSA对炎症因子IL-6和TNF-α转录的抑制效应．这些结果表明：GSNOR是一个新的重要炎症调控分子,它可能成为调控NO介导的炎症相关信号通路的新的潜在靶点,上调GSNOR可能是抑制炎症的新思路．本研究揭示了巨噬细胞通过上调iNOS和下调GSNOR共同增强免疫炎症反应的新机制,拓展了对NO代谢在炎症反应中作用机制的认识．     

染色质免疫沉淀技术分析肺腺癌A549细胞中p53蛋白与p21CIP1和Bim基因转录启动子的结合

为了检测肺腺癌A549细胞内抑癌蛋白p53与CDK抑制蛋白p21CIP1和Bim基因转录调控区的结合情况,采用染色质免疫沉淀技术,用p53特异性抗体沉淀DNA,PCR检测p21CIP1和Bim基因5′端特异性序列.结果表明,在抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p21CIP1和Bim基因5′端的特异性序列.因此证实在A549细胞内,p53蛋白可与p21CIP1和Bim基因转录启动子的特异区域结合,进而参与两基因的表达调控.     

染色质免疫沉淀技术分析肺腺癌A549细胞中p53蛋白与p21^CIPI和Bim基因转录启动子的结合

为了检测肺腺癌A549细胞内抑癌蛋白p53与CDK抑制蛋白p21^CIPI和Bim基因转录调控区的结合情况,采用染色质免疫沉淀技术,用p53特异性抗体沉淀DNA,PCR检测p21^CIPI和Bim基因5’端特异性序列。结果表明,在抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p21^CIPI和Bim基因5’端的特异性序列。因此证实在A549细胞内,p53蛋白可与p21^CIPI和Bim基因转录启动子的特异区域结合,进而参与两基因的表达调控。     

细菌GntR家族转录调控因子的研究进展

GntR家族转录调控因子是细菌中分布最为广泛的一类螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)转录调控因子,此家族转录调控因子包含两个功能域,分别是N端的DNA结合结构域和C端的效应物结合结构域/寡聚化作用结构域.DNA结合结构域的氨基酸序列是非常保守的,但效应物结合结构域/寡聚化作用结构域的氨基酸序列...