测量细胞内吞过程中膜受体流动性的新方法

本文首次提出用ＡＢＣ（ＡｖｉｄｉｎＢｉｏｔｉｎＣｏｍｐｌｅｘ）法标记细胞膜受体,通过ＦＲＡＰ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲｅｃｏｖｅｒｙＡｆｔｅｒＰｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术,测量细胞内吞过程中受体流动性变化的方法。实验选择巨噬细胞ＣｏｎＡ受体,比较了用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）和ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ（直接法）标记的膜表面ＣｏｎＡ受体荧光强度和内吞过程中受体的流动性测量结果。结果显示ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ标记的巨噬细胞膜受体的平均荧光强度比用ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ标记的平均荧光强度高大约３倍;ＡＢＣ法标记的受体,测量结果误差小、灵敏度高;ＣｏｎＡ刺激１５ｍｉｎ后,巨噬细胞膜表面ＣｏｎＡ受体的扩散系数和荧光恢复率较静息状态时明显下降。讨论了两种标记方法对测量结果的影响     

ABC法在膜受体支流性测量中的应用

本文首次把ＡＢＣ法应用于反体流动性测量中的膜表面体荧光标记,利用ＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ａｆｔｅｒ Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术实现了细胞内吞过程中膜受体流动变化的测量。实验用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ和Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）标记巨噬细胞ＣｏｎＡ受体,测量ＣｏｎＡ刺激不同时间细胞膜表面受体的荧光强度、扩散系数和荧光恢复率的变化。结果显示ＡＢＣ标记法适合于     

ATP对巨噬细胞内吞和溶酶体pH的影响

ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ标记培养的小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体,ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ标记细胞内吞。用激光扫描共聚焦显微镜测量伴刀豆球蛋白（ＣｏｎＡ）、ＡＴＰ引起的巨噬细胞溶酶体ｐＨ动态变化和ＡＴＰ对细胞内吞ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ的影响。结果显示ＣｏｎＡ引起巨噬细胞溶酶体ｐＨ迅速增加,６ｍｉｎ左右达到峰值（ｐＨ５．７）;ＡＴＰ刺激３０ｍｉｎ后再加入ＣｏｎＡ,溶酶体ｐＨ无明显变化（ｐＨ４．０）;同时加入ＡＴＰ和ＣｏｎＡ,５ｍｉｎ左右溶酶体ｐＨ降到最低点（ｐＨ４．１）;ＡＴＰ对巨噬细胞内吞ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ有明显的抑制作用。探讨了受体介导内吞与溶酶体ｐＨ的关系。     

巨噬细胞吞噬过程中膜磷脂流动性和受体流动性的关系

本文用ＦＲＡＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｃｏｖｅｒｙａｆｔｅｒｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术,测量了静息状态和刀豆素Ａ刺激不同时间后巨噬细胞膜磷脂、ＣｏｎＡ受体扩散系数和荧光恢复率的变化。结果显示ＣｏｎＡ刺激后膜磷脂和ＣｏｎＡ受体的扩散系数和荧光恢复率均较静息状态的巨噬细胞明显降低,磷脂流动性的变化与ＣｏｎＡ受体流动性的变化呈正相关。提示受体介导内吞导致的膜磷脂流动性的降低,可能是由于配体与细胞膜上受体结合形成配体－受体复合体,增加了受体的负荷,使受体的流动性降低,进而使膜磷脂的流动性降低。巨噬细胞内吞过程中膜磷脂和ＣｏｎＡ受体流动性的降低,可能还与ＣｏｎＡ刺激后巨噬细胞胞浆ｐＨ值有关。     

巨噬细胞细胞内吞过程中膜受体流动性的测量——两种标记受体方法的比较

本文首次实现了细胞内吞过程中膜受体流动性的测量。实验选择巨噬细胞膜和伴刀豆凝集素A(ConA),分别用Con A-Biotin Avi-din-FITC(ABC法)和Con A-FITC(直接法)两种方法标记巨噬细胞膜Con A受体,比较了这两种方法标记的巨噬细胞Con A受体的荧光强度;利用FRAP(Fluorescence RecoveryAfter Rhotobleaching)技术,分别用两种标记方法测量了巨噬细胞Con A受体的流动性。结果显示Con A-Biotin Avidin-FITC标记的巨噬细胞受体的平均荧光强度比用Con A-FITC标记的平均荧光强度高大约3倍;直接标记法应用于细胞内吞过程中受体流动性的测量在方法学上存在着很大的缺陷,ABC标记法适合于测量细胞内吞过程中膜表面受体的流动性的变化,且灵敏度高、误差小;ABC方法标记受体的测量结果显示,Con A刺激后巨噬细胞膜表面Con A受体的扩散系数和荧光恢复率与静息状态相比呈下降趋势。     

伴刀豆球蛋白A与巨噬细胞膜受体结合对膜下F－actin的影响

配体与膜受体结合可启动细胞信息传递通路,激活细胞并产生生物学效应。应用共聚焦激光扫描显微术,流式细胞分光光度计,生物活性测量等技术,研究ＭＡ与巨噬细胞膜受体结合后,膜下肌动蛋白丝构筑和含量随时间变化,以及细胞热能量改变。结果是ＣｏｎＡ结合巨噬细胞膜受体后,膜下肌动蛋白多聚化加快,构筑成细胞内Ｆ－ａｃｔｉｎ立体空间网络,Ｆ－ａｃｔｉｎ含量增加具有时间相关性,细胞热能量增加。巨噬细胞内这些变化提示ＣｏｎＡ通过膜受体诱导膜下肌动蛋白多聚化和构筑过程有信息传递和激活细胞等重要作用。     

伴刀豆球蛋白A与巨噬细胞膜受体结合对膜下F－actin的影响

配体与膜受体结合可启动细胞信息传递通路,激活细胞并产生生物学效应。应用共聚焦激光扫描显微术,流式细胞分光光度计,生物活性测量等技术,研究ＭＡ与巨噬细胞膜受体结合后,膜下肌动蛋白丝构筑和含量随时间变化,以及细胞热能量改变。结果是ＣｏｎＡ结合巨噬细胞膜受体后,膜下肌动蛋白多聚化加快,构筑成细胞内Ｆ－ａｃｔｉｎ立体空间网络,Ｆ－ａｃｔｉｎ含量增加具有时间相关性,细胞热能量增加。巨噬细胞内这些变化提示ＣｏｎＡ通过膜受体诱导膜下肌动蛋白多聚化和构筑过程有信息传递和激活细胞等重要作用。     

Wistar大鼠和RCS大鼠视网膜色素上皮细胞和视杆细胞外节表面Con－A受体

为探讨正常大鼠与吞噬功能缺陷大鼠视网膜色素上皮（ＲＰＥ）和视杆细胞外节（ＲＯＳ）膜表面的甘露糖受体的存在和分布,本实验用胶体金标记物对１２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠和１２只ＲＣＳ大鼠的ＲＰＥ细胞及临近其顶部的ＲＯＳ表面的Ｃｏｎ－Ａ受体进行标记．结果表明。两种大鼠ＲＰＥ细胞及ＲＯＳ膜表面均有胶体金标记物．胶体金标记物在两种ＲＰＥ细胞微绒毛上分布密度较低,而在两种大鼠ＲＯＳ膜表面分布密度则高。说明两种大鼠ＲＰＥ细胞和ＲＯＳ膜表面均有Ｃｏｎ－Ａ受体分布。在两种大鼠ＲＯＳ被ＲＰＥ细胞吞入后,均无胶体金标记物。     

以FITC作为荧光探针研究金属硫蛋白的构象变化

本文以异硫氰基荧光素（ＦＩＴＣ）作为荧光探针标记于金属硫蛋白分子上,用荧光光谱研究了Ｃｄ＾２＋及Ａｇ＾＋离子与ＺｎＭＴ２－ＦＩＴＣ进行金属交换及与ＡｐｏＭＴ２－ＦＩＴＣ进行金属重组时的构象变化。结果表明,标记后ＭＴ与Ｃｄ＾２＋离子进行金属交换及金属重组时不具有明显的结构域特征,而Ａｇ＾＋离子进行金属交换及金属重组时,分别在Ａｇ６ＭＴ、Ａｇ１２ＭＴ及Ａｇ１８ＭＴ处具有明显的结构域形成特征。此外高温下     

ABC法在膜受体流动性测量中的应用

本文首次把ABC法应用于受体流动性测量中的膜表面受体荧光标记,利用FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)技术实现了细胞内吞过程中膜受体流动性变化的测量.实验用Con A—Biotin和Avidin—FITC(ABC法)标记巨噬细胞ConA受体,测量ConA刺激不同时间细胞膜表面受体的荧光强度、扩散系数和荧光恢复率的变化.结果显示ABC标记法适合于测量细胞内吞过程中膜表面受体的流动性变化,且具有较高的灵敏度高;巨噬细胞受ConA刺激后,膜表面ConA受体的扩散系数和荧光恢复率较静息状态时明显降低.     

用凝集素和非同位素标记底物测定核心α－1，6－岩藻糖转移酶及其应用

报道了一个不需同位素和ＨＰＬＣ的α－１,６－岩藻糖转移酶（α１,６ＦｕＴ,又称核心岩藻糖转移酶）的测定法,包括从正常人血浆提纯运铁蛋白,消化成带有天冬酰胺（Ａｓｎ）的二天线Ｎ－糖链,去除外端唾液酸和半乳糖后,用生物素酰胺乙酰基团标记其Ａｓｎ,并以此生物素衍生物标记的Ａｓｎ－七糖的Ｎ－糖链为受体底物,ＧＤＰ－Ｌ－岩藻糖为供体底物,用ＬＣＡ柱吸附法分离岩藻糖化后的产物,再用ＨＲｐ－Ａｖｉｄｉｎ交联物与柱上带有生物素的产物结合,此ＨＲＰ－Ａｖｉｄｉｎ－生物素。岩藻糖化产物从柱上洗脱后测定ＨＲＰ活力可代表α１,６ＦｕＴ活力。此法在较宽的范围内,产物量与酶量和反应时间成正比．人肝细胞癌、亚硝胺诱发大鼠肝癌后期或用佛波酯（ＰＭＡ）处理人肝癌细胞后,α１,６ＦｕＴ增高,而用视黄酸或ｄｂ－ｃＡＭＰ处理人肝癌细胞后,则该酶活力降低。     

胃粘膜肠上皮化生与胃癌关系的组织化学和免疫组织化学研究

应用ＡＢ（ｐＨ１．０）ＫＯＨ／ＰＡＳ粘液组织化学和ＡＢＣ法凝集素标记,对１９０例胃粘膜病变标本进行观察。结果表明,结肠不完全型肠上皮化生多见于肠型癌（ＩＴＣ）及其癌旁组织。两型肠化在弥漫型癌（ＤＴＣ）中无显著差异。５种凝集素受体的含量和分布的差异与胃癌的组织学类型和分化程度有关。ＷＧＡ、ＲＣＡ和ＰＮＡ主要标记在ＤＴＣ中,与ＩＴＣ相比,有非常显著的差异（Ｐ＜０．０１）。其染色水平随肿瘤分化程度的降低而升高。ＣｏｎＡ和ＤＢＡ主要标记在ＩＴＣ和伴有肠化的慢性萎缩性胃炎中。凝集素肠化分型与粘液肠化分型基本相符。我们认为结肠不完全肠化与ＩＴＣ的发生关系密切,而小肠型和结肠完全型肠化可能与ＤＴＣ的发生有关。     

毛喉萜对小鼠骨髓细胞和腹腔巨噬细胞表面胰岛素受体和GM－CSF受体的下调作用

放射性标记受体分析表明毛喉萜（ＦＳＫ）可以降低小鼠骨央细胞和腹腔巨噬细胞表面的胰岛素（ＩＮＳ）和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）受体数目,而且对ＧＭ－ＣＳＦ的作用有剂量和时间依赖性,经ＦＳＫ处理的巨噬细胞酸性磷酸酶活性增加,微丝更加舒展。     

氧化脂质及对大鼠心肌肌质网Ca~（2＋）－ATPase磷酸化微区运动状态的影响

用ＴＢＡ法测定了三尖杉酯碱的膜脂氧化效应;用纳秒荧光偏振技术研究了氧化膜脂对ＤＰＨ标记大鼠心肌肌质网膜脂、ＡＮＭ标记心肌肌质网Ｃａ２＋－ＡＴＰａ功能及磷酸化微区运动状态的影响。随膜脂中氧化磷脂的增加,肌质网膜脂双层的微粘度增加,磷脂分子摆动角减小：ＤＰＨ的荧光强度减弱,荧光寿命缩短。Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的ＡＴＰ水解活性降低。ＡＮＭ标记Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ磷酸化微区的ｒ（ｔ）曲线半衰期减至６８±４ｎｓｅｃ。结果提示,膜脂中氧化磷脂的含量影响膜脂双层的流动性及Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的ＡＴＰ水解活性和磷酸化微区的微细结构。     

氧化HDL_2在大鼠肝窦状隙细胞内代谢

大鼠肝窦状隙细胞培养结果显示：氧化高密度脂蛋白２（ｏｘ－ＨＤＬ２）对异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）荧光标记ｏｘ－ＨＤＬ２的细胞结合有竞争抑制作用,而ＨＤＬ２则无。细胞内吞ＦＩＴＣ－ｏｘ－ＨＤＬ２的荧光强度（ＦＳ）和［３Ｈ］ＣＥ－ｏｘ－ＨＤＬ２（ｒ－ｏｘ－ＨＤＬ２）的放射强度分别是内吞ＦＩＴＣ－ＨＤＬ２的４５．５％和ｒＨＤＬ２的６１．４％。内吞ＦＳ主要存在于三氯醋酸（ＴＣＡ）沉淀部分,而放射强度主要存在于ＴＣＡ上清液部分。细胞释放的ＦＳ和放射活性分别是内吞量的６７．７％和１０．９％,且主要存在于ＴＣＡ可沉淀部分。结果提示：（１）大鼠肝窦状隙细胞可能存在着ｏｘ－ＨＤＬ受体,该受体不同于ＨＤＬ受体。（２）ｏｘ－ＨＤＬ２在细胞内代谢方式与ＨＤＬ２相似,均没有经历溶酶体分解途径。在细胞内载脂蛋白与胆固醇酯（ＣＥ）组分经历一个解离过程。细胞截留大部分ＣＥ后,将载脂蛋白（Ａｐｏ）与剩余ＣＥ重组成脂蛋白并以逆向胞饮方式释放到胞外。（３）氧化修饰减弱ＨＤＬ２逆向转运胆固醇能力     

PAF对肺内小动脉平滑肌细胞TXA_2，PGI_2乃Ca~（2＋）－ATPase的影响

本工作采用分离培养家兔肺内小动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣｓ），观察了外源性血小板活化因子（ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＰＡＦ）、ＢＮ５２０２１（ＰＡＦ受体拮抗剂）、吲哚美辛、维拉帕米对ＰＡＳＭＣｓ产生血栓素Ａ_２（ＴｘＡ_２）、前列环素（ＰＧＩ_２）及对细胞膜Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力的影响。结果表明：（１）基础状态下ＰＡＳＭＣｓ存在花生四烯酸（ＡＡ）代谢。（２）外源性ＰＡＦ通过受体后途径激活环加氧酶促进ＡＡ代谢致ＴＸＡ_２及ＰＧＩ－２增加，ＴＸＡ_２／ＰＧＩ_２比值无明显变化。（３）外源性ＰＡＦ能直接抑制Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力。（４）维拉帕米可逆转ＰＡＦ抑制ＰＡＳＭＣｓ膜Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力的效应。     

氧化脂质及对大鼠心肌肌质网Ca^2＋—ATPase磷酸化微…

用ＴＡＢ法测定了三尖杉酯碱的膜脂氧化效应;用纳秒荧光偏振技术研究了氧化膜脂对ＤＰＨ标记大鼠心肌肌质网膜脂、ＡＮＭ标记心肌肌质网Ｃａ＾２＋－ＡＴＰａ功能及磷酸化微区运动状态的影响。随膜脂中氧化磷脂的增加,肌质网膜脂双层的微粘度增加,磷脂分子摆动角减小;ＤＰＨ的荧光强度减弱,荧光寿命缩短。Ｃａ＾２＋－ＡＴＰａｓｅ的ＡＴＰ水解活性降低。ＡＮＭ标记Ｃａ＾２＋－ＡＴＰａｓｅ磷酸化微区的ｒ（ｔ）曲线半衰期减至     

抗寒剂对水稻线粒体膜流动性的冷稳定作用

抗寒剂对水稻线粒体膜流动性的冷稳定作用王红,简令成,张举仁（中国科学院植物研究所,北京１０００４４）（山东大学生物系,济南２５０１００）ＥＦＦＥＣＴＯＦＴＨＥＣＯＬＤ－ＲＥＳＩＳＴＥＲＣＲ－ＲＥＳＩＳＴＥＲＣＲ－４ＯＮＴＨＥＣＯＬＤ－ＳＴＡＢＩＬＩＴ...     

UV照射与非UV照射FITC致敏小鼠淋巴结树突状细胞的光电镜免疫组织化学特性

本工作观察了小鼠淋巴结树突状细胞（ＤＣ）的光、电镜免疫组织化学特性,并探讨其功能。从ＦＩＴＩＣ致敏小鼠淋巴结分离的ＤＣ在体外可刺激ＦＩＴＣ特异性Ｔ－细胞株增殖。注射经ＵＶ照射、ＦＩＴＣ致敏的小鼠淋巴结细胞（ＤＬＮＣ）至受体小鼠,可导致该小鼠的免疫耐受;这些细胞在体外仍可促进ＦＩＴＣ特异性Ｔ－细胞株增殖,但明显弱于非ＵＶ照射小鼠ＤＬＮＣ的作用。免疫光镜下显示ＵＶ－ＦＩＴＣ致敏小鼠淋巴结的ＦＩＴＣ阳性ＤＣ与非ＵＶ照射ＦＩＴＣ致敏组一样也表达了ＭＡＣ－１、２、３和Ｆ４／８０等巨噬细胞标志,唯其ＦＩＴＣ阳性细胞率明显高于非照射ＦＩＴＣ致敏组动物。免疫电镜下显示这些细胞呈Ｉａ阳性和ＦＩＴＣ阳性,ＦＩＴＣ主要定位于线粒体和溶酶体结构等处。研究表明这些与ＦＩＴＣ致敏小鼠ＤＬＮＣ有关的细胞活性的差异与Ｉａ阳性ＤＣ数量减少、表面Ｉａ的表达、ＦＩＴＣ在ＤＣ内的分布变化无关。某些Ｉａ阳性ＤＣ胞质内可见Ｂｉｒｂｅｃｋ颗粒样结构,提示Ｉａ阳性ＤＣ的不同群体可迁移至ＵＶ照射小鼠的淋巴结。     

DIDS和ConA对带3蛋白转运活性及结构的影响

测定了伴刀豆球蛋白（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）和ＤＩＤＳ对人红细胞带３蛋白活性及结构的影响。（１）ＣｏｎＡ使带３转运速度常数Ｋ显著增加。ＣｏｎＡ浓度达到０．０５ｍｇ／ｍｌ时,Ｋ值增加３４．４％。ＤＩＤＳ对带３活性有明显的抑制作用。（２）荧光探针ＤＰＨ,３ＡＳ,９ＡＳ,１６ＡＰ分别测定ＣｏｎＡ和ＤＩＤＳ与带３结合后膜流动性的变化。ＣｏｎＡ能明显增加膜脂的流动性,而ＤＩＤＳ则降低膜脂流动性。（３）差示扫描量热法（ＤＳＣ）测定带３蛋白变性性质,发现ＣｏｎＡ使红细胞膜上带３蛋白变性峰出现温度从６９．２５°Ｃ减小到６６．２５°Ｃ,而ＤＩＤＳ则使之增至７９．５°Ｃ。