胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能;同时,在Cre基因3′端添加了含内含子的3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠;RTPCR结果表明其中1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因,进一步的Southern杂交结果表明,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶。      

精子特异性 Sleeping Beauty 转座酶转基因小鼠模型的建立

目的：建立精子特异性表达Sleeping Beauty （ SB）转座酶转基因小鼠模型,为研究SB转座子在小鼠中的应用提供工具。方法克隆精子特异性启动子用以驱动SB转座酶基因的表达,建立精子特异性表达SB转座酶的载体,利用显微注射方法建立以C57BL/6J为背景的精子特异性表达SB转座酶的转基因小鼠。 PCR鉴定首建鼠的基因型,western blot（WB）和免疫组织化学（IHC）检测SB转座酶基因在小鼠生殖腺睾丸中的表达情况,筛选睾丸中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结果显微注射方式获得了5只首建小鼠,其中3只能稳定传代,利用WB和IHC成功的筛选出一株在精子中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结论成功建立了精子特异性高表达SB转座酶转基因小鼠模型,为将SB转座子作为一种基因工程工具应用于小鼠基因修饰模型的建立提供非常重要的工具资源。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β-乳球蛋白基因(BLG)作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工具,构建了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,经PCR和Southern\|Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG-tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汁中检测到tPA的活性,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合在小鼠基因组中的牛BLGtPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。     

组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体——长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将它插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAtPA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,再将所构建的BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和Southern印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的9只F1代子鼠中,有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1～2μg/ml,BLGtPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β－乳球蛋白基因（BLG）作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工龄,构建了组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,以PCR和Southern-Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG－tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汗中检测到tPA r itd ntg ,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合的小鼠基因组中的牛BLG－tPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的：将人的钙蛋白酶抑制蛋白（ calpastatin, CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法利用Gateway技术构建pRP．EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57 BL/6 J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100％,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9％。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

转基因小鼠乳腺表达长效组织纤溶酶原激活剂

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将其插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAt-PA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,将此构建BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和DNA印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的F1代子鼠中,9只中有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1-2μg/ml,说明BLG-tPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。为今后利用牛、羊作为生物反应器表达LAtPA奠定了基础。     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

ＢＬＧ—ＬＡtPA和鼠ＷＡＰ共注射提高ＬＡtPA在转基因小鼠乳腺中的表达水平

为了提高长效组织纤溶酶原活剂（ＬＡtPA）在转基因小鼠乳腺中的表达水平,将受控于羊β－乳球蛋白（ＢＬＧ）的ＬＡtPA表达载体ＢＬＧ－ＬＡtPA与小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因片段进行共注射,采用此方法建立的转基因小鼠,经ＰＣＲ筛选和Ｓouthern印迹鉴定,获得３只ＬＡtPA和ＷＡＰ共整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的ＬＡtPA表达,表达水平达到１０μg/mL。     

小鼠输精管内转染法建立人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺定位？…

The most established methods for development of transgenic animals are the microinjection of DNA into the fertilized eggs, but it is still a procedure of certain complexity and high cost. Therefore, the idea of using sperm as a vehicle to carry exogenous DNA into eggs is very attractive, and there have been some successful reports. Though the methods are rather simple they sometimes have low reproducibility. To improve the technique we transinfected the spermatozoa in testicular duct, not in vitro, to produce mice which expressed human tissue plasminogen activator (tPA) in mammary gland. The results demonstrated that: (1) 5 transinfected mice mated 10 female mice in 10 days after operation, (2) 79 founders were developed and 42 survived, (3) using PCR to detect foreign DNA integrated into the genome of founders, 7 out of 42 founders were positive (16.67%), (4) The expression level of tPA was 48-80 ng/ml in the milk of 5 PCR positive founders and (5) the foreign DNA integrated into the genome was detected in 2 out of 4 1st offspring by PCR technique.     

绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表达

建立绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,继而传代建系。采用显微注射法,将GFP基因注入FVB／NJ小鼠受精卵原核内,获得子代鼠。分娩后3周剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southern印迹技术进行整合检测。结共用雌性小鼠200只,注射受精卵1586枚,移植卵数386枚,受体鼠32只,怀孕鼠4只,子代鼠18只,有4只为阳性：取2只首建鼠的胚胎,在荧光显微镜下观察GFP表达明显,表明初步获得了转绿色荧光蛋白基因小鼠,     

嗜铬颗粒蛋白A基因的反义转基因小鼠模型的建立及该基因启动子的组织特异性

构建小鼠嗜铬颗粒蛋白A（Chromogranin,A,CGA)基因的反义DNA载体pGAS1C－lacZ。用电穿孔的方法将该载体转化大鼠肾上腺髓质细胞瘤细胞系PC－12,X－Gal染色后证明位于CGA基因启动子下游的报告基因lacX已经表达。用限制性内切酶除去载体的质粒骨架后,显微注射入供体昆明小鼠的受精卵中,随后将注射过DNA的受精卵移植入假母的输卵管中,完成正常的胚胎发育。用PCR的方法筛选假母产下的小鼠,得到CGA基因反义RNA基因首建鼠14只。将首建鼠分别与正常昆明鼠交配,产生后代。取首建鼠的肾上腺进行X－Gal染色,组织用于石蜡切片,根据各鼠肾上腺切片的蓝色深浅判定转入基因量的高低,筛选到两只表达量高的首建鼠,留下它们的后代。取转基因鼠的各种组织用于X－Gal染色,发现报告基因在肾上腺、胰腺的胰岛中有表达,而在肌肉、脂肪组织中无表达,说明CGA基因的启动子具有神经内分泌组织特异性。     

显微注射法制备转基因小鼠的技术研究

转基因技术是发生工程学或胚胎操作技术中的一部分。这一技术包括有受精卵的采集,受精卵的体外培养,胚胎移植等技术,转基因动物制作是其应用技术之一,它是将外源ＤＮＡ片段用显微注射法直接注入受精卵原核,使外源ＤＮＡ随机整合到寄主基因组中而形成转基因小鼠。我们建立完善这一技术的目的是在实验动物的生产中为转基因动物的生产提供稳定可靠的保证。我们将ｐＣＸＴＧＡＰ、ｐＣＳＬＮ等基因分别注入受精卵原核制备相应的转基因动物模型,并从中总结较佳的操作技术。结果经检测阳性转基因小鼠占出生幼鼠的１６３８％。我们认为不仅要有精细的微注射技术、动物的选用和饲育、严密的胚胎操作都是转基因动物制作成功的重要条件。     

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白（mRFP）转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只（R3和R4）鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP（R1、R2和R5）或荧光强度（R6）与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只（R1、R2、R3、R4和R5）基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉（RNAi）,并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

PCR扩增同源重组片段筛选转基因胚胎

使用小鼠乳清酸蛋白基因（ＷＡＰ）启动子控制下的人集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因为显微注射片段,采用ＰＣＲ方法检测了转基因胚,为消除ＰＣＲ扩增中的假阳性结果,构建了两个具有部分同源性的亚克隆片段进行共注射．ＰＣＲ扩增片段跨越这一同源区域,仅当注射的片段能够整合并发生正常重组,转基因整合胚才能以相对高的比例扩增出特异性片段．结果表明,１、２和８细胞期的阳性率分别为１１．１％、５５．５％和４４．４％,较常规ＰＣＲ检测获得更为明确的结论,为在大动物转基因胚胎检测提供了依据     

转hDAF基因小鼠的构建(英文)

本工作构建了含有ｈＤＡＦ基因的转基因小鼠,以便研究ｈＤＡＦ基因能否消除异种器官移植中的排斥反应。 采用ＤＮＡ重组的方法构建ｈＤＡＦ基因的表达载体ｐＳＰ６４ＨＰ（Ｆｉｇ．１）。通过受精卵显微注射,将其中的目的基因片段,转移到小鼠体内,建立转基因小鼠。再通过Ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ杂交方法对出生小鼠的基因组特征进行查证。 连续两次对直接裂解菌液做ＰＣＲ扩增,筛选出重组质粒（Ｆｉｇ．２＆３）,酶切图谱（Ｆｉｇ．４）和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（Ｆｉｇ．５）分析结果与预期吻合,出现预期条带;小鼠受精卵注射后存活比率为７７．９％,受精卵的发育率为３．４％,出生小鼠中,１０．５％出现清晰杂交信号。 表明：ｈＤＡＦ基因表达载体构建成功;并整合入小鼠基因组中。     

TNNT3~（R69H）突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-TNNT3（R69H）转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3（R69H）注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达。结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠。对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3（R69H）在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。