人癌细胞线粒体DNA控制区序列特征分析

为了探讨癌细胞mtDNA控制区序列的变化特征, 采用PCR产物限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析与直接测序相结合的方法,对比分析6株人癌细胞系、 6例癌患者及4例健康成人白细胞mtDNA控制区序列。发现第16519位T→C、16 534位A→G、46位T→G和49位A→C突变, 在癌细胞系和癌患者白细胞mtDNA中分别占50%(3/6)和33.3%(2/6), 健康成人白细胞mtDNA中未见此类型突变;第16 278位C→T突变,在癌细胞系mtDNA中占50%(3/6),显著高于正常人群mtDNA中此位点的多态性变异。表明癌细胞和癌患者白细胞mtDNA重链复制起点及其 相邻D环区的特征性突变可能与细胞癌变/或癌的易感性有关。 Abstract：　To explore the sequence feature of mitochondrial DNA(mtDNA) control region in human carcinoma cells, polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) and direct sequence techniques were used to analyze the sequence of mtDNA control region of 6 human carcinoma cell lines versus white blood cells which from 6 tumor patients and 4 normal adults. The T to C mutation at np 16 519, A to G mutation at np 16 534, T to G mutation at np 46, and A to C mutation at np 49 was found in 50% (3/6 cases) of carcinoma cell lines and in 33.3%(2/6 cases) of tumor patients, but it was not found in normal adults. The C to T mutation at np 16 278 was found in 50%(3/6 cases) of carcinoma cell lines, it was significantly higher than that of the polymorphism of normal population. These findings suggest that the typical mutation in the starting area of heavy-strand replication and the first half of D-loop region might probably be associated with carcinogenesis or susceptibility of carcinoma.     

扬子鳄饲养种群线粒体DNA控制区的序列多态性

扬子鳄(Alligator sinensis)是中国特有的珍稀爬行动物,至2000年,野生扬子鳄的个体数已不足150条,作为保护这一物种的措施之一,先后于80年代初建起了2个养殖场,现人工繁殖的扬子鳄总数已达9000余条。为揭示扬子鳄种群遗传多样性,从两个饲养种群中采集了42个个体的样品,其中宣州样品33个(xZSP),长兴样品9个(CxSP),用PCR方法扩增mtDNA控制区,扩增产物纯化后直接用ABI310全自动遗传分析仪荧光标记测序,得到其中39个个体的血DNA控制区5’端462bP的序列。经比对发现,39个个体间的5’端mtDNA控制区没有任何变异位点,共享一种单元型,提示扬子鳄饲养种群的遗传多样性非常贫乏,造成这一结果的主要原因是近50年来,扬子鳄种群衰退和数量迅速减少导致的遗传多样性丢失,其次是人工繁殖的群体同时受到始创者数量较少产生的瓶颈效应影响。针对扬子鳄遗传多样性的现状,作者最后就这一濒危动物遗传多样性的保护对策提出3点建议。     

从线粒体DNA控制区核苷酸序列论达式鲟、亚洲和北美洲中吻鲟的分类地位

尽管古老的鲟形目鱼类的分类及系统演化一直是中外学者感兴趣的研究课题 ,但迄今仍有诸多谜团未解。其中 ,关于亚洲远东地区和北美地区的中吻鲟 (Acipensermedirostris)的分类地位争论已久。长江水系的达式鲟 (A .dabryanus)和中华鲟 (A .sinensis)及其它鲟属 (Acipenser)鱼类之间的亲缘关系近年来也有异议。为了给上述争议提供更多的科学依据 ,作者测定了线粒体DNA (mtDNA)控制区(D loop) 的核苷酸序列 ,并进行了分子系统学和遗传差异分析。研究结果表明 :⑴UPGMA ,NJ和MP分子系统学分析方法以及遗传差异分析都支持了亚洲远东地区中吻鲟和北美中吻鲟为一个有效种的观点 ;⑵同样研究方法并结合相关群体遗传资料表明 ,长江达式鲟与中华鲟关系最近 ,提出了达式鲟为中华鲟的一陆封类群的假说。最后 ,作者认为本文提出的观点和假说还需要更多的研究来证实。     

转基因小鼠乳腺表达G-CSF的研究

用PCR法从正常中国人脐带血提取总DNA作为模板,扩增出1.5 kb的人G-CSF基因组基因。序列分析证实其正确性。将其插入小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的起始密码子ATG前的KpnⅠ位点,使其受控于2.6kb的WAP调控序列,构建成乳腺表达载体pWGG。回收经EcoRⅠ酶切后的8.7kb片段用于显微注射。共注射1200枚受精卵,移植34受体母鼠,产仔鼠85只。经PCR检测和DNA印迹分析,证实获得两只整合有人G-CSF基因的雄性鼠,整合率为2.37％。建立的转基因鼠系表明,采用ELASA方法对F1代雌鼠乳汁检测,成功地表达出人G-CSF。表达量为120～250ng/ml。这一结果表明转基因的表达具有乳腺特异性。这为在大动物中实施转基因提供了依据。     

红腹锦鸡线粒体DNA控制区结构和遗传变异研究

红腹锦鸡(Chrysolophus pictus)是中国特有珍稀鸟类,仅见于中国中部和西部的山地,为国家二级重点保护动物.采用聚合酶链式反应和直接测序的方法测定了采自湖南新宁县和龙山县的28只红腹锦鸡线粒体DNA控制区序列.在获得的1 123 bp的碱基序列中,碱基含量为T 32.79%、C 26.07%、A 26.62%和G14.52%,共检测出20个多态性核苷酸变异位点,其中简约信息位点11个.对比其它已报导的雉类控制区结构,对红腹锦鸡控制区结构进行了分析,识别了其高变Ⅰ区、中间保守Ⅱ区和保守Ⅲ区,找到了与终止相关的序列TAS以及保守序列(F、E、D、C).28个样本共发现11种单倍型,其中单倍型hap1和hap2的比例很高.新宁种群的遗传多样性比龙山种群的高,两个种群存在基因流较频繁,未出现明显遗传分化.     

红鲫部分线粒体DNA序列变异分析

对红鲫19尾个体的线粒体tRNA-Thr基因、tRNA-Pro基因和部分控制区的核苷酸序列进行了测定．获得19条长度为836～837bp的同源基因序列,共发现18个变异位点．定义了4种单元型．在红鲫4种单元型中确认了DNA复制终止相关的序列TAS、中央保守区序列（CSB-F、CSB-E和CSB-D）和保守序列CSB1．在18个变异位点中,除一个缺失外,序列变异全部为转换,无颠换发生．4种单元型之间的序列差异在0．1％。1．7％之间．结果显示,红鲫群体具有较高的遗传多样性水平,因而暗示了它具有较强的适应外界环境变化的能力,同时说明它是鱼类遗传育种的较好实验材料．     

三倍体湘云鲫线粒体DNA序列变异性分析

对26尾三倍体湘云鲫的线粒体tRNA-Thr基因、tRNA-Pro基因和部分控制区的核苷酸序列进行了测定,获得26条长度为837—839 bp的同源基因序列,共发现65个多态性核苷酸变异位点,多态位点比例为0.077,定义了8种单元型。在湘云鲫8种单元型中确认了DNA复制终止相关的序列TAS、中央保守区序列(CSB-F、CSB-E和CSB-D)和保守序列CSB1,8种单元型含有3—5个TAS序列。在65个变异位点中,大部分序列变异为转换,8种单元型之间的序列差异在0.1%—6.3%之间。该研究为三倍体湘云鲫的繁殖和遗传改良提供了一些有价值的信息。     

鼬科动物线粒体DNA控制区结构分析

利用PCR技术获得紫貂(Martes zibellina)和黄喉貂(Martes flavigula)线粒体DNA控制区全序列,并结合从GenBank中下载的9种鼬科动物相应序列,用ClustalX排序后对控制区结构进行分析,识别出延长终止序列区、中央区和保守序列区3个区域,指出了一个终止相关序列ETAS1及8个保守序列(CSB-F、E、D、C、B、1、2和3),并给出了序列通式,在CSB1和CSB2之间发现不同形式的短重复序列.此外,以狼为外类群,应用邻接法构建鼬科线粒体控制区全序列的系统进化树,结果表明:臭鼬亚科最先从鼬科中分化出来,随后剩余类群分为两大支系,即貂属种类与貂熊聚为一支,并与獾亚科的狗獾形成姐妹群;另一支为水獭亚科的物种与鼬属的林鼬形成姐妹群,再与虎鼬聚在一起,狗獾与貂属的紫貂亲缘关系最近,水獭亚科与鼬属亲缘关系最近.     

龙种金鱼和蛋种金鱼线粒体DNA控制区的序列分析

利用PCR技术扩增了红龙睛、墨龙睛、虎头和水泡眼4种金鱼线粒体DNA控制区部分核苷酸序列,长度分别为724、724、720、722bp.测序结果显示,龙种金鱼红龙睛、墨龙睛的线粒体DNA控制区的序列完全相同,同源性为100%;蛋种金鱼虎头、水泡眼的序列相差4个碱基,同源性为99.4%.研究表明,这4个金鱼品种之间的同源性都很高,而同品系金鱼的亲缘关系相对较近.引用Genbank中鲫鱼的序列,构建了金鱼和鲫鱼的NJ分子系统树,从分子水平证实了金鱼起源于鲫鱼.     

西藏小型猪的线粒体DNA控制区分析

目的研究西藏小型猪的遗传标记以及与其他国内地方猪的亲缘关系。方法扩增102头西藏小型猪以及16头巴马小型猪、17头贵州香猪的线粒体DNA控制区,测序并与国内其他猪进行比较。结果西藏小型猪线粒体DNAD-loop区分三个区域。串联重复序列区处于中间位置,包含有15～29个10 bp的重复片段,分为A、B两种类型。D-loop 3′端340 bp,与国内其他猪的序列相同比较保守;5′端704 bp,共有22个变异位点。由22个变异位点中归纳出25个单倍型,其中有两种主要的单倍型,分别占34.4%和36.6%。根据三个转换位点：305、500、691,将西藏小型猪分成了两组,几乎与串联重复序列所分的A、B两组类型相对应。与西藏小型猪相比,巴马小型猪和贵州香猪D-loop 5′端变异位点较少,分别只有4种和2种单倍型,串联重复区也只有一个类型。结论西藏小型猪可能有两个母系祖先并且与我国西南地区的品种猪有较近的亲缘关系;不同的串联重复片段类型和5′端的变异位点可以联合组建西藏小型猪的遗传标记。     

云南猕猴mtDNA控制区全序列测定

目的测定云南猕猴线粒体DNA控制区全序列,对其进行鉴定及进化分析。方法利用PCR技术扩增猕猴线粒体DNA控制区全序列,结合GenBank中下载的猕猴参考序列（AY612638）,采用多个生物学软件对序列碱基组成、同源性、转换／颠换比等遗传信息进行分析,并基于邻接法（NJ）和最小进化法（ME）构建系统进化树。结果云南猕猴线粒体DNA控制区全长为（1084-1089）bp,A、T、G和c四种碱基平均含量分别为29．9％、26．9％、12．3％和30．9％,A＋T含量（56．8％）高于G＋C含量（43．2％）。所分析序列间的同源性为91．5％-99．5％,平均核苷酸变异率为4．5％,变异类型包括转换、颠换、插入和缺失4种形式,转换／颠换比值平均为26．1。进化树显示云南猕猴存在两个平行进化的姐妹分支。结论本研究获得了云南猕猴mtDNA控制区全序列,为猕猴进化关系研究及mtDNA控制区功能研究奠定基础。     

Investigation of Heteroplasmy in the Human Mitochondrial DNA Control Region: A Synthesis of Observations from More Than 5000 Global Population Samples

Instances of point and length heteroplasmy in the mitochondrial DNA control region were compiled and analyzed from over 5,000 global human population samples. These data represent observations from a large and broad population sample, representing nearly 20 global populations. As expected, length heteroplasmy was frequently observed in the HVI, HVII and HVIII C-stretches. Length heteroplasmy was also observed in the AC dinucleotide repeat region, as well as other locations. Point heteroplasmy was detected in approximately 6% of all samples, and while the vast majority of heteroplasmic samples comprised two molecules differing at a single position, samples exhibiting two and three mixed positions were also observed in this data set. In general, the sites at which heteroplasmy was most commonly observed correlated with reported control region mutational hotspots. However, for some sites, observations of heteroplasmy did not mirror established mutation rate data, suggesting the action of other mechanisms, both selective and neutral. Interestingly, these data indicate that the frequency of heteroplasmy differs between particular populations, perhaps reflecting variable mutation rates among different mtDNA lineages and/or artifacts of particular population groups. The results presented here contribute to our general understanding of mitochondrial DNA control region heteroplasmy and provide additional empirical information on the mechanisms contributing to mtDNA control region mutation and evolution. Electronic supplementary material  The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

大趾鼠耳蝠线粒体DNA控制区结构及变异

采用PCR产物直接测序法首次测定大趾鼠耳蝠(Myotis macrodactylus)10个个体的线粒体DNA(mtDNA)控制区全序列,并进行了结构和变异分析。结果表明,大趾鼠耳蝠的控制区结构与其他哺乳动物相似,可分为一个中央保守区(包括F、E、D、C、B元件)和两个外围结构域:延伸的终止结合序列区(包括ETAS1和ETAS2元件)和保守序列区(包括CSB1、CSB2和CSB3元件),其中最为保守的是中央保守区(核苷酸变异度为1.8%)。大趾鼠耳蝠控制区核苷酸全序列具有丰富的长度多态性(1778～2048bp),主要是由在碱基组成、重复数目和排列方式上异质的串联重复序列造成的。在ETAS内发现了TACAT及其反向互补序列ATGTA,支持滑移错配模式(slipped mispairing model)。本研究为该物种的进一步研究和保护提供基础遗传数据。     

人类线粒体DNA变异的检测方法和思路

基于线粒体DNA（mtDNA)的研究对于人群源流迁移、线粒体相关疾病病因的探讨和法医鉴定等具有重意义,就检测人线粒体突变的一些常用方法,如RFLP、SSO和控制区测序等作一小结和归纳,并重点介绍目前mtDNA突变的筛选方法和思路,另外,还总结了近年来对人mtDNA方面的研究结果,对世界人群中主要单倍型类群（haplogroup)特征变异位点和相应的酶切检测引物作了归纳。     

鲹科鱼类线粒体DNA控制区结构及系统发育关系

采用PCR技术获得了9种鲹科鱼类的线粒体DNA控制区全序列,并结合从GenBank中下载的3种鲹科鱼类的相应序列采用ClustalW排序后,对控制区结构进行分析,识别了其终止序列区、中央保守区和保守序列区3个区域,指出了终止相关序列的主体是TACAT与其反向互补序列ATGTA以及一系列保守序列(CSB-F、CSB-E、CSB-D和CSB-1、CSB-2、CSB-3),并给出了它们的一般形式,同时在康氏似鲹控制区的5′和3′两端发现重复序列。以尖吻鲈作为外类群,应用邻接法构建的分子系统树表明:鲹科鱼类分为鲹亚科、鰤亚科、鲳鲹亚科和鰆鲹亚科4个亚科,各自形成单系群;鲹亚科与鰤亚科形成姐妹群,鲳鲹亚科再与他们聚在一起,鰆鲹亚科处于鲹科鱼类的基部,与前面3个亚科聚在一起。     

鳄龟科和平胸龟科线粒体控制区序列分析和结构比较

本文参照龟类近缘种的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区(control region,CR)及邻接序列,设计了二对特异引物,采用PCR和测序技术,获得了大鳄龟(Macroclemys temminckii)、小鳄龟(Chelydra serpentina)和平胸龟(Platysternon megacephalum)mtDNA CR区序列,其长度分别为1062bp、1124bp和1119bp;A T的含量分别为68.93%、69.34%和69.44%。序列分析显示,三种龟CR区3'末端均存在丰富的微卫星序列,其中大鳄龟和小鳄龟各有一段2bp的TA序列分别重复20和15次;小鳄龟另有一段5bp的TATAT序列重复13次;平胸龟则是一段10bp的AGTATGTTAT序列重复4次和一段17bp的GTTGTTATATAACATAT序列重复13次。本文还结合GenBank中已发表的其他6种龟鳖类动物的控制区序列,探讨了龟鳖类动物微卫星序列的类型及分布,结果表明:9种龟鳖类动物都存在丰富的微卫星序列,且微卫星所在位置及序列存在很大差异。     

Frequency and Pattern of Heteroplasmy in the Control Region of Human Mitochondrial DNA

In this work, we present the results of the screening of human mitochondrial DNA (mtDNA) heteroplasmy in the control region of mtDNA from 210 unrelated Spanish individuals. Both hypervariable regions of mtDNA were amplified and sequenced in order to identify and quantify point and length heteroplasmy. Of the 210 individuals analyzed, 30% were fully homoplasmic and the remaining presented point and/or length heteroplasmy. The prevalent form of heteroplasmy was length heteroplasmy in the poly(C) tract of the hypervariable region II (HVRII), followed by length heteroplasmy in the poly(C) tract of hypervariable region I (HVRI) and, finally, point heteroplasmy, which was found in 3.81% of the individuals analyzed. Moreover, no significant differences were found in the proportions of the different kinds of heteroplasmy in the population when blood and buccal cell samples were compared. The pattern of heteroplasmy in HVRI and HVRII presents important differences. Moreover, the mutational profile in heteroplasmy seems to be different from the mutational pattern detected in population. The results suggest that a considerable number of mutations and, particularly, transitions that appear in heteroplasmy are probably eliminated by drift and/or by selection acting at different mtDNA levels of organization. Taking as a whole the results reported in this work, it is mandatory to perform a broad-scale screening of heteroplasmy to better establish the heteroplasmy profile which would be important for medical, evolutionary, and forensic proposes.