用去除标记基因的霉菌重组技术商业化植酸酶

荷兰Gist～Brocades公司开发了从基因重组体中确实去除标记基因的技术,并实际应用于从94年在欧洲正式开展事业的饲料添加用酶——植酸酶制剂"Natuphos"的生产。使用的宿主是黑曲霉Aspergillus     

黑曲霉WY-6植酸酶的表达、纯化及性质研究

目的:表达黑曲霉WY-6植酸酶基因及研究重组酶的性质。方法:通过PCR方法从黑曲霉WY-6基因组中扩增出植酸酶基因,并将该基因表达在毕赤酵母中,再利用蛋白质分离纯化技术对重组酶进行纯化,并测定其性质。结果:黑曲霉WY-6植酸酶基因成功表达在毕赤酵母中,重组植酸酶经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤和阴离子交换层析步骤后得以纯化,纯化后的植酸酶比活力为147U/mg,分子量为67kDa,两个最适pH分别为3.0和5.5,最适温度为55℃,与胃蛋白酶以0.01的比率(胃蛋白酶/植酸酶,wt/wt)混合作用2h后仍保留70.9%残余活力。结论:获得了具有商业应用潜能的基因工程植酸酶。     

重组杂交油菜的商业化在加拿大获得认可

比利时PGS International公司95年5月9日宣布加拿大粮农部批准该公司商业栽培重组杂交油菜(F_1油菜)。该部认为,这种重组F_1油菜可作动物饲料使用。栽培重组F_1油菜,对环境也无不利影响。该公司已得到加拿大卫生部许可作为食品销售重组F_1油莱。 该公司领先世界开发了生产F_1种子用的亲株制作技术“Seedlink”(通过结合使用向花粉细胞特异的     

月见草种子油开发利用简史

近年来,路旁野草月见草(Oenothera biennis L. )引起世界各国极大兴趣。荷兰、联邦德国、意大利和英国四处求购月见草种子。日本民众掀起食用月见草油制品(保健胶囊、糖果等)热潮。全球约有三十个国家重视月见草种子油的研究与利用。国外,生产经销月见草油制品已有专门公司,     

植酸酶基因工程菌构建及其生产应用中问题分析

简要分析了植酸酶的生物学特性以及构建植酸酶基因工程菌和酶生产应用中存在的问题,提出了对植酸酶基因的重组改造、载体表达宿主筛选的方法和途径,以求构建高效表达、高活性和高稳定性的酶基因工程菌,促进酶的生产和应用。     

重组番茄食品的安全性在英国得到认可并于年内销售

英国Zeneca公司1月5日宣布以该公司开发的重组番茄为原料生产的加工食品得到英国农业部的安全性认可。Zeneca公司预计95年底在英国销售使用这种重组番茄生产的番茄糊和番茄酱等加工食品。顺利的话,在英国将是第一个重组食品。 Zeneca公司的重组番茄是抑制使细胞壁软化的酶—聚半乳糖醛酸酶(PG)的表达的。1994年3月经在美国Calgene公司、美国Campbell Soup公司之间协商。Zeneca公司仍具有加工用重组番茄(使     

易错PCR技术提高黑曲霉N25植酸酶活力的研究

利用易错PCR技术对黑曲霉(Aspergillus niger)N25的植酸酶基因phyA进行定向进化研究,突变基因产物重组于表达载体pET32a(+)中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,经筛选获得了最佳突变菌株pET32a-phyAep,其植酸酶活力比出发酶提高了41.8%。突变酶的酶学性质研究发现,与野生酶相比,它的热稳定性,最适温度和最适pH值无显著变化。     

Calgene获得反义植物专利

Calgene 获得了第一个在基因工程植物中使用反义技术的专利。专利号4,801,540保护延伸开的种植架生产水果的专有西红柿植物。Calgene 以前宣布,该公司已成功地利用反义重组 DNA 技术减少与成熟果实软化有关普通西红柿酶(多聚半乳糖醛酸酶或 PG)的存在。该公司的技术涉及到用“反义 PG”基因的工程植物以便极大地减少该酶的产生。反义西红柿是由该公司与 Campbell Soup 公司合作投资开发的。Campbell Soup 公司拥有世界西红柿权,且是     

植酸酶和甘露聚糖酶双功能毕赤酵母工程菌的构建和产酶分析

根据已发表的植酸酶基因和甘露聚糖酶基因序列设计并合成引物,应用PCR技术,分别以土曲霉总DNA和质粒pHBM1201为模板,扩增出均不含假定信号肽序列的植酸酶基因phyA和甘露聚糖酶基因man,将它们各自克隆到毕赤酵母表达载体pHBM907C上,分别得到重组质粒pHBM907C-phyA和pHBM907C-man。将质粒pHBM907C-phyA上由乙醇氧化酶(AOX1)启动子和终止子引导表达、酿酒酵母α信号肽序列引导分泌的phyA表达盒式结构插入到质粒pHBM907C-man中,构成双基因表达分泌质粒pHBM907C-phyA-man。pHBM907C-phyA-man经SalⅠ酶切线性后转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得了同时分泌表达植酸酶和甘露聚糖酶的双功能酵母工程菌。研究了该酵母工程菌所分泌表达的重组植酸酶和甘露聚糖酶的相关酶学性质,并进行了双功能酵母工程菌的稳定性测试。     

美重组淀粉酶得到该国FDA认可在世界上首次实现商品化

美国CPC International公司(新泽西州恩格尔伍德克列夫斯的子公司Enzyme Bio-Systems(EBS)公司用重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生产的淀粉酶“BMA”已得到美国食品及药物管理局(FDA)的认可。这种“BMA”是来自巨大芽孢杆菌(B.megaterium)的酶,能提高从淀粉生产葡萄糖的过程的产量的作用。由于该菌在大量培养时酶的产率很低,所以由重组枯草芽孢杆菌的生产有很高的实用价值(参阅本刊1987年3月9日     

黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达

目的:克隆植酸酶基因phyA,构建毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母,并对重组工程菌的表达产物进行初步酶学性质研究.方法:以植酸酶高产菌株-黑曲霉Z6染色体DNA为模板,PCR扩增得到植酸酶基因phyA,序列鉴定后连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-phyA,电击转化毕赤酵母KM71,筛选得到重组转化子.对重组工程菌表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究.结果:phyA序列分析表明该基因具有典型的植酸酶活性位点保守序列ArgHisGlyAlaArgTyrPro,与NC-BI已发表的植酸酶基因同源性较高,达到94%以上.该序列已提交GenBank,序列号为DQ318022.重组工程菌KM71-phyA7的PCR扩增证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中,植酸酶能有效分泌和表达,粗酶液酶活可达875U/mL.结论:植酸酶基因phyA在毕赤酵母中成功表达,为今后的定向改组奠定了基础.     

Novo公司在美国开始生产重组酶

丹麦Novo Nordisk公司继日欧之后,也在美国开始利用重组微生物生产酶.Novo Nordisk公司的美国法人Novo Nordisk Biochem公司整顿了重组酶的生产体制. Novo公司最初在美国生产的重组酶是用于淀粉工业和纤维工业的耐热性α-淀粉酶.用生产菌芽孢杆菌属菌株的基因重组提高了产物的产率. 该公司去年10月就重组菌用于工业生产这一专题邀请了工厂所在社区的居民和立法、行政当局召开了约60人的说明会.     

大肠杆菌植酸酶基因appA的克隆与高效表达

从猪粪便中分离并筛选出高效生产酸性植酸酶和磷酸酶双功酶(appA植酸酶)的大肠杆菌菌株。通过PCR方法从该菌株基因组中扩增获得了植酸酶基因appA,测序结果显示该基因编码区全长1,299个核苷酸。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a( )上,通过转化的大肠杆菌BL21在试管摇床培养条件下得到了高效表达,其表达量达到692U／mL。酶学特性分析表明其反应的最适pH为4．5,最适温度为60℃。     

毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较

将本实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut 重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut 和MutS重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。     

烟曲霉菌热稳定性植酸酶在黑曲霉菌中的分泌性表达

在先前克隆获得烟曲霉菌植酸酶phyA基因并构建了重组质粒的基础上,将该质粒转化黑曲霉菌pyrG基因缺陷株M54;同时制备植酸酶多克隆抗体用于植酸酶的免疫学检测。SDS-PAGE和western-blot结果表明,phyA在黑曲霉菌中获得分泌性表达。表达产物活性测定结果显示,重组植酸酶的表达量为597.6 IU/mL。在90℃加热10 min和100℃加热20 min后,重组植酸酶残余酶活分别为74%和70%,具有较好的热稳定性。实现了烟曲霉菌植酸酶在黑曲霉菌中的分泌性表达,表达产物具较高的生物活性和耐热性。     

新的表达克隆法

世界最大的产业用酶厂家丹麦Novo Nordisk公司表示正在实用化不必纯化酶、但克隆酶的基因,以曲霉为宿主大量生产酶的新系统。该系统是首先使用大肠杆菌构建编码酶的、真菌的DNA文库。接着在酵母中导入文库基因,获得在平皿上检测酶活性的菌株,再将基因移到曲霉Aspergillus上,大量生产具有目的活性的酶。Novo公司正在配备用该系统大量生产的酶是“Monocomponent enzyme(单一成分酶)”。Novo公司确立以洗涤剂用脂酶为开湍事业化的新系统可以说是很有优势的。 Novo公司11月销售的纤维加工用重组纤维素酶制剂也是用该系统开发的产品。据说这种单一成分酶可高效率地分解非结晶区域的纤维素的结合,但强度不会降低且有效地防止起绒毛。     

饲料中添加植酸酶可减少磷的排泄

协和发酵公司发现向broiler(鸡)的饲料中添加可分离谷类中含量高的植酸中的磷酸的酶植酸酶,就可使排泄物中的磷量减少3成左右。该公司与日本科学饲料协会经过4年左右共同研究,确认了植酸酶的效果,并在94年秋和95年春的日本家禽学会上发表了其成果。该组发现植酸酶对猪也有同样的效果,但没有发表。协和发酵公司按饲料添加物的新型指定最近向农林水产省申请将植酸酶作为新的饲料添加物。经农     

用植物细胞生产重组蛋白

京都大学水学部植物病理学教授古泽(?)男等小组利用一种花叶病毒(BMV),在植物细胞大量生产重组γ干扰素(IFNγ)(全蛋白量的10%)成功。用再现的植物体追试这项结果,可开发在大田生产重组蛋白的分子农业。该氏估算完成这项技术制造重组蛋白每1克约2～3日元。分子农业是比利时 PlantGenetic System 公司提倡的技术,1989年该公司利用油菜籽白蛋白基因,生产低分子的脑内肽获得成功。麒麟啤酒公司与帝京大学共同以烟草花叶病毒为载体用烟草生产脑啡肽。用这种方法只能生产5个氨     

不同添加方式植酸酶处理豆粕对牙鲆生长和饲料利用率的影响

以初始平均体重(2.02±0.02)g的牙鲆(Paralichthys olivaceus)为实验对象,进行为期70d的摄食生长实验,研究不同添加方式的植酸酶对牙鲆生长和饲料利用的影响。在5000.0g豆粕中添加2.5g植酸酶,然后用产朊假丝酵母(Candidautilis)进行发酵预处理,得到植酸酶预处理豆粕。共制作4种等氮等能(粗蛋白49.7%、总能20.9kJ/g)饲料,对照饲料主要以鱼粉为蛋白源;在对照饲料的基础上,用豆粕蛋白替代45%的鱼粉蛋白配制成豆粕组饲料;在每千克豆粕组饲料中添加1000IU植酸酶,配制成植酸酶组饲料;用植酸酶预处理豆粕蛋白替代45%的鱼粉蛋白配制成植酸酶预处理豆粕组饲料。结果表明,与对照组相比较,用豆粕蛋白替代饲料中45%的鱼粉蛋白,若不添加植酸酶则显著降低牙鲆的特定生长率(P0.01)、饲料效率、蛋白质效率和氮贮积率(P0.05);直接添加植酸酶组、植酸酶预处理豆粕组牙鲆的特定生长率、饲料效率、蛋白质效率和氮贮积率与鱼粉对照组相比较没有出现显著差异(P0.05);与不添加植酸酶的豆粕组相比较,在含豆粕饲料中添加1000IU/kg饲料的植酸酶显著提高牙鲆的特定生长率(P0.01)、氮贮积率(P0.05)和磷贮积率(P0.01),显著降低氮排放率(P0.05)和磷排放率(P0.01),但饲料效率和蛋白质效率没有显著变化(P0.05);在豆粕中添加植酸酶进行发酵预处理,降低了豆粕中植酸含量,在饲料中添加植酸酶预处理豆粕显著提高牙鲆的特定生长率(P0.01)、饲料效率、蛋白质效率和氮贮积率(P0.05),显著降低氮(P0.05)、磷和钙的排放率(P0.01)。       

荷Unilever公司利用酵母菌代替大肠杆菌作宿主

荷兰Unilever公司进行了产醇氧化酶的酵母多形汉逊酵母(Hansenula Poyforma的应用开发,用它代替大肠杆菌供重组蛋白克隆用的宿主。该公司的生物科学研究所Theo Verripe主任研究员为首的小组用多形汉逊酵母先进行了食品工业用重组蛋白的克隆。