编码人生长激素的DNA序列在大肠杆菌中的直接表达

编码人生长激素的DNA通过用化学合成的DNA与酶促制备的CDNA连接而建立。这一“杂化物”基因在乳糖操纵子控制下在大肠杆菌中表达,产生的肽在大小和免疫学性质上具有成熟的人的生长激素的特性。 人生长激素(HGH)是垂体前叶合成的具有191个氨基酸的蛋白质。垂体机能减退 的侏儒因HGH缺陷而身材矮小,在儿童期使用人生长激素可以治疗这一缺陷症。另外,HGH在治疗各种创伤疾病如骨折、皮肤烧伤、溃疡等被证实是有效的。由于生长激素具种属专一性,人的尸体成为HGH的唯一来源。 生长激素mRNA的初级翻译产物是一个蛋白前体,含有与生长激素N末端相接的一段信号肽。这种信号或“前”序列是分泌蛋白的特征。对于大鼠生长激素(RGH),已经鉴定了由RGH mRNA制备的CDNA序列中前序列的26个氨基酸残基。由人生长激素cDNA序列获得的信息,我们设计并建立了一个细菌质粒,它可以在微生物细胞中指导合成大量的成熟HGH。     

性逆转石斑鱼脑垂体差异表达基因克隆的筛选

以17α甲基睾丸酮投喂赤点石斑鱼(Epinephelusakaara),成功地获得了性逆转的有功能的雄鱼。用SMARTcDNA合成和长片段PCR技术构建了性逆转前后脑垂体cDNA文库;用抑制消减杂交技术建立了性反转前后抑制性差减文库。对获得的560个雄鱼脑垂体PCR阳性克隆和350个雌鱼脑垂体PCR阳性克隆进行斑点杂交,共筛选到103个差异表达cDNA片段。对其中29个克隆进行了测序,与GenBank中的已知基因序列进行同源性比较,发现有6个片段为促性腺激素α亚基前体基因(GenBank注册号:AY207430),与同属不同种的石斑鱼促性腺激素α亚基前体基因有97%的同源性;1个片段为生长激素前体(GenBank注册号:AY207431),与同属不同种的石斑鱼生长激素前体基因有99%的同源性;其余22个cDNA片段与GenBank中的序列无明显同源性 。     

应用聚合酶链反应改造蛙鱼生长激素cDNA

为了在大肠杆菌中表达天然序列的娃鱼生长激素基因,本研究应用聚合酶链反应扩增方法改造娃 鱼生长激素cDNA,成功地扩增出编码蛙鱼生长激素成熟肤的序列,并在该序列的5端和3端分别引 人EcoRI和BamHI的识别序列,使之便于进入载体,获得亚克隆。结果表明：应用聚合酶链反应扩 增及分子克隆方法改造蛙鱼生长激素cDNA较传统的DNA重组方法简便,效率高。文中对聚合酶链 反应扩增中非预期突变进行了讨论。     

牛生长激素cDNA的分子克隆

我们克隆了与牛生长激素Poly(A)⁺RNA互补的DNA(cDNA)。首先从小牛垂体中提纯总的Pply(A)⁺RNA,用AMV逆转录酶合成单链cDNA,以单链cDNA为模板合成双链cDNA,用多聚G及多聚c谱尾法将双链cDNA克隆到pBR322质粒的Pst I位点上,构建成牛垂体PoIy(A)⁺RNA的cDNA文库。以牛生长激素基因为探针,筛选出7个阳性菌落,经电泳鉴定有两个菌落(1号和2号)含有大于500bp的插入片段。1号克隆经酶切图谱、southeTn blot 杂交及序列分析证实含有牛生长激素的编码序列。     

cDNA微阵列分析人apoE4转基因鼠肾脏基因表达谱的变化

目的研究人apoE4转基因鼠肾脏的基因表达谱变化.方法分别提取人apoE4转基因鼠和正常C57BL/6J小鼠的肾脏总RNA,经逆转录合成cDNA探针后分别与鼠cDNA表达点阵杂交,再用ESTblot软件进行分析,并用Northern印迹证明基因表达的改变.结果人apoE4转基因鼠肾脏中有38个基因的mRNA表达升高,22个基因的mRNA表达降低.其中血浆谷胱甘肽过氧化物酶前体、视黄酸γ受体和白介素5受体等基因的表达明显增加.B-raf原癌基因、促红细胞生成素受体、整联蛋白α4的基因表达显著降低.Northern杂交证明转基因鼠肾脏的c-Jun基因表达升高.结论人apoE4转基因鼠肾脏的c-Jun、血浆谷胱甘肽过氧化物酶前体、白介素5受体等基因的表达增加;促红细胞生成素受体、整联蛋白α4等基因的表达减少.     

牛生长激素抗体的制备及其纯化

 <正> 生长激素是垂体前叶分泌的蛋白质类激素,它在体内有多种生物学效应。近年来,对生长激素的作用机理及生长激素基因工程的研究报道很多,国内也开始了这方面的工作。我们实验室从1984年开始进行牛生长激素基因工程的研究。在这项研究中,为获得牛生长激素基因的探针,首先需要有高纯度牛生长激素mRNA。双抗体免疫沉淀法是分离、纯化特异mRNA的有效方法,采用这种方法分离牛生长激素(bGH)mRNA,需要有高纯度bGH抗体。此外,高纯度牛生长激素抗体对于检测生长激素cDNA在细菌中的表达,对于制备亲和层析     

猪垂体中猪生长激素基因的克隆和部分序列分析

从猪垂体中提取出DNA,以EMBL3噬菌体作裁体,构建了染色体基因文库。用全长的猪生长激素(pGH)cDNA作探针,经原位杂交,筛选出5个阳性克隆。提取其中一个阳性克隆的DNA,通过斑点杂交,酶解和Southern印迹,表明它含有全长猪生长激素基园,将sma Ⅰ酶解后soufhem印迹为阳性的两个片段进行了亚克隆,对其中含有猪生长激素基因sma Ⅰ位点上游序列的片段进行了部分序列分析,并和已发表的相应序列进行了比较。     

猪生长激素cDNA的全序列分析

本文报道了两个猪生长激素cDNA的全序列分析的结果。猪生长激素cDNA是我们由猪垂体mRNA经过反向转录、克隆和筛选后获得的。文中还将这两个序列与Seeburg等(1983)报道的序列以及Vize等(1987)报道的猪基因组生长激素基因的序列进行了比较和讨论。     

革胡子鲶生长激素cDNA克隆与蛋白质结构分析

从革胡子鲶(Clarias lazera(Burchell))的脑垂体组织中提取总RNA, 应用RT-PCR方法, 扩增得到了革胡子鲶生长激素(Growth hormone, GH)基因cDNA的开放阅读框(Open reading frame, ORF)序列。ORF全长为603 nt, 编码由22个信号肽氨基酸和178个成熟肽氨基酸共同组成的生长激素前体蛋白。序列同源比较结果表明, 研究中得到的革胡子鲶生长激素氨基酸序列与GenBank中已报道的其他6种鲶形目鱼类的氨基酸序列同源性高达95.8%。二级结构预测分析结果表明, 革胡子鲶生长激素蛋白中含有a 螺旋、b 折叠和b 转角以及无规卷曲等二级结构, 以a 螺旋为主, 是典型的a 型结构蛋白质。此外, 抗原性分析表明, 在氨基酸序列中的4个区域均可形成优势抗原表位, 其结构特点非常适合改造成为重组生长激素疫苗或单克隆抗体制剂加以开发利用。     

定量测定黑鲷生长激素受体mRNA的液相杂交/RNase保护法

目的　建立液相杂交 核糖核酸酶保护测定 (RibonucleaseProtectionAssay,RPA)技术定量检测黑鲷(Sparusmacrocephalus)生长激素受体mRNA水平。方法　将黑鲷生长激素受体cDNA片断亚克隆至pGEM T载体 ,制备特异性的放射性反义RNA探针及正义RNA ,将反义RNA探针与正义RNA及样品总RNA进行液相杂交 ,用RNaseA和RNaseT1 降解杂交产物的单链RNA ,双链杂交体得到保护 ,然后检测杂交体的分子大小及放射强度。结果　检测出了黑鲷生长激素受体反义RNA探针与正义RNA及样品总RNA的特异性杂交片断 ,由此建立了定量测定黑鲷生长激素受体mRNA的液相杂交 RNase保护法 ,并采用该方法在黑鲷的多种组织中检测出了生长激素受体基因的表达 ,表达水平在肝脏中最高。该结果与我们曾采用生长激素放射受体分析法对黑鲷生长激素受体所研究的结果相吻合。结论　为进一步深入研究鱼类生长激素受体分子内分泌的调控理论提供了有力手段。     

生长抑素基因有结构变异

生长抑素(SS)是具有广泛生理活性的14肽(S14),已在人及鼠、鱼等的几种组织内确认了其前体分子、并发现了SS的另一活性形式S28。通过cDNA核苷酸序列分析,在anglerfish及鲐鱼胰内分泌组织均发现有两种SS mRNA,分别对应121肽及125肽的SS前体分子;但在人和鼠的内分泌瘤组织仅发现有一种cDNA,编码116肽的前生长抑素原。美国德州大学CJ Su等新近又从牛胰提取出前生长抑素原的cDNA,据此编码出的116肽SS前体分子的一级结构与其它哺孔类SS前体极其近似,但有少数氨基酸差异。通过Nothern印渍法分子杂交,在胎     

人成纤维细胞成纤维蛋白质cDNA片段的分离及亚克隆

我们用噬菌斑原位杂交的方法从人成纤维细胞cDNA基因库(λNMT-pCD-cDNA重组体)中分离到一株成纤维蛋白质cDNA克隆。经限制性内切酶酶切电泳及吸印转移法分析证明这是一个成纤维蛋白质cDNA片段克隆,并进一步将此cDNA片段克隆到pBR322质粒上。     

牛和猪的生长激素在细菌中高效率表达

用垂体的Poly(A)mRNA制备的cDNA含有牛和猪生长激素(bGH,pGH)编码序列,并在细菌中克隆。由各自cDNA的核苷酸序列而得知的肽激素的一级结构大约有90％的同源性。为了组建能在细菌中高效产生成熟的动物生长激素的表达质粒,利用合成DNA的方法来修饰克隆的cDNA。     

毕赤酵母高效分泌长效人生长激素的研究

目的:为了延长人生长激素(HGH)在血浆中的半衰期,构建了高效分泌表达人血清白蛋白(HSA)与HGH融合蛋白(HSA-HGH)的工程毕赤酵母菌株。方法:从人胎肝cDNA文库中扩增HSA基因,从HGH工程菌载体中扩增HGH基因,将其克隆至真核表达载体pHIL-D2,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过原位双层膜法筛选高效分泌表达菌株。分别采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定融合蛋白。对工程酵母培养条件进行研究,发酵液经离子交换层析、亲和层析和分子筛层析纯化。纯化的蛋白经N端序列测定,分子量测定和等电聚焦电泳进行鉴定。冻干的蛋白制剂经食蟹猴试验进行药代动力学和药效动力学测试。结果:确立了工程酵母的最佳培养工艺,融合蛋白表达量达100mg/L。纯化后蛋白纯度达95%以上,得率达42%。融合蛋白与预期结果一致,经食蟹猴试验,显示有良好的生物活性,与等摩尔剂量的重组人生长激素相比,半衰期延长6.8倍,清除率慢44倍。结论:融合蛋白呈现明显的长效动力学特征,为开发重组长效人生长激素HSA-HGH融合蛋白药物(rHSA-HGH)奠定了基础。     

大洋渔业公司证实金枪鱼生长激素在大肠杆菌中表达

日本大洋渔业公司与京都大学已共同证实金枪鱼生长激素cDNA的克隆化,和在大肠杆菌的表达。这项成果已于1988年4月1～4日在东京召开的日本水产学会上发表。关于cDNA的克隆化已在1987年的学会上发表。他们已把编码成熟型金枪鱼生长激素(187个氨基酸、分子量2.1万)的基因区整合人表达载体,并导入大肠杆菌。其结果,发现20％的菌体蛋白可以表达。表达是用使用针对精制     

大肠杆菌表达重组人生长激素的纯化

目的 :获得具有生物学活性的重组人生长激素 (rhGH)。方法 :PBV -GH/DH5α菌体经超声破菌、反复洗涤后获得包涵体。将包涵体变性、复性 ,用硫酸铵盐析 ,离子交换层析和凝胶层析进行纯化。产物经SDS -PAGE、HPLC、N末端 15个氨基酸序列检测验证。结果 :终产物rhGH纯度达 98.2 % ,比活性大于 3.0IU/mg。分子量为 2 2kDa ,N末端氨基酸序列与DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。结论 :从自构建的PBV -GH/DH5α工程菌中获得高纯度、高活性重组人生长激素。其纯化工艺为中试生产提供可靠依据。     

斑马鱼神经介素S直系同源基因的克隆、序列分析及组织表达

旨在更深入和广泛了解脊椎动物NMS前体基因的结构、进化和生理功能,利用生物信息学和分子生物学技术从斑马鱼脑组织中克隆得到了NMS前体基因序列,并对其基因和蛋白结构以及组织表达等方面进行了分析。结果表明,斑马鱼NMS前体基因cDNA序列编码110个氨基酸组成的多肽,其中包含22个氨基酸的信号肽。脊椎动物NMS前体蛋白序列比对结果显示,与哺乳动物不同,硬骨鱼类NMS前体蛋白在C端缺失很大一部分序列,不能形成类似哺乳动物的NMS成熟肽,经蛋白酶切割可能形成同源性较高的34个氨基酸的多肽。进化树和基因组分析显示,斑马鱼和青NMS前体蛋白聚类在一起,位于NMS这一分支上。同时,NMS前体基因在斑马鱼、青和人基因组中具有同线性关系。半定量RT-PCR结果显示,NMS前体基因在所检测的斑马鱼各组织中均有表达,其中以脑中表达量为最高。     

草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达

为大量获得具有生物学活性的草鱼生长激素,对草鱼生长激素cDNA在毕赤酵母中的表达进行了研究。将草鱼生长激素cDNA克隆入毕赤酵母表达载体pGAPZ-α-B,构建表达载体pGAPZ-α-B-GH。在三磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子的调控作用下,一个类似于天然生长激素大小、分子量约22kD的蛋白获得表达,其表达量约50mg/L。Western杂交表明：表达的蛋白与兔抗草鱼生长激素的多克隆抗体特异结合,证实该表达蛋白为草鱼生长激素;受体夹心式ELISA检测表明：表达的草鱼生长激素具生物学活性,能与不同种鱼来源的肝膜受体特异结合。     

黄颡鱼重组生长激素的制备及对其鱼苗生长的影响

生长激素在渔业生产中具有重要的应用价值, 通过制备黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)同源重组生长激素并用于促生长实验, 从而为建立鱼苗快速培育方法提供理论依据。根据已知黄颡鱼生长激素(PfGH)基因cDNA序列, 利用IPTG诱导和SDS-PAGE分析方法, Western印迹表明在IPTG终浓度1.0 mmol/L、温度17℃和培养时间14h的条件下, 黄颡鱼生长激素基因在大肠杆菌中大量表达, 获得重组生长激素蛋白。然后, 随机选取黄颡鱼分为4组放入室内水族箱中进行养殖, 每箱35尾, 体质量为(0.850.01) g, 每组设3个平行, 水体循环净化。用制备的重组生长激素浓度分别为0、1、5和10 mg/L对黄颡鱼进行浸泡处理, 每周一次, 0为对照组。在养殖4周后, 对各组增重率和特定生长率进行比较, 结果表明1 mg/L组增重率和特定生长率分别比对照组提高了29.67% (P0.05)和11.90% (P0.05), 5 mg/L组增重率和特定生长率分别比对照组提高了21.32% (P0.05)和8.83% (P0.05), 各组间体成分等均无明显差异。停用生长激素4周后, 各组黄颡鱼的生长性能、体成分等均无显著差异。研究表明通过原核表达可以获得黄颡鱼重组生长激素, 用于促进鱼苗生长培育的最佳浸泡浓度为1 mg/L。       

猪生长激素cDNA在芽孢杆菌中的表达

利用随机克隆的枯草杆菌启动子-信号序列构建茅孢杆菌分泌载体pUS186。用限制酶将切除了信号序列的猪生长激素cDNA从质粒pLY3-PGH 604切下,亚克隆至pUS186,并在该cDNA的下游接上地衣杆菌α-淀粉酶基因的转录终止子,构建猪生长激素表达质粒pSGH 1864,将此质粒转化蛋白酶双缺陷的枯草杆菌DB104及短小茅孢杆菌289。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检出在发酵上清液中多出一条22kD的蛋白带,抗猪生长激素血清免疫印迹法证明这一蛋白带具有免疫活性,表明猪生长激素cDNA已在枯草杆菌及短小茅抱杆菌中表达。