东方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究

东方肉座菌EU7-22具有高产半纤维素酶的能力。根据已报道的同属里氏木霉及绿色木霉木聚糖酶,木糖苷酶相关基因序列,设计PCR引物扩增出东方肉座菌内切木聚糖酶(XYNⅠ,XYNⅡ)及β-木糖苷酶(β-BXL)基因。序列经NCBIBlast分析:东方肉座菌xynⅠ基因与里氏木霉xyn1基因(X69573.1)的同源性最高达到91%;xynⅡ基因与绿色木霉xyn2基因(EF079061)同源性最高达到93%;β-bxl基因与里氏木霉β-bxl1基因(Z69257.1)的同源性最高达到94%。生物信息学分析表明内切木聚糖酶Ⅰ和Ⅱ均属于糖基水解酶家族11,N末端前19个氨基酸均为信号肽。内切木聚糖酶Ⅰ分子量为24.13kD,等电点为7.87,含有3个糖基化位点;内切木聚糖酶Ⅱ分子量为24.44kD,等电点为4.86,含有1个糖基化位点;β-木糖苷酶属于糖基水解酶家族3,分子量为87.27kD,等电点为5.49,N末端前20个氨基酸为信号肽,含有8个糖基化位点。利用SWISS-Model对木聚糖酶,木糖苷酶蛋白质三级结构进行了预测和模拟。对木聚糖酶和木糖苷酶基因及其编码蛋白质的生物信息学分析,为进一步研究这些基因的表达与调控、构建高效利用纤维素组份的工程菌株奠定基础。     

东方肉座菌EU7-22纤维素内切酶Ⅰ的异源表达

[目的]实现东方肉座菌纤维素内切酶EGⅠ在毕赤酵母中的表达,获得重组EGⅠ。[方法]通过RT-PCR获得EGⅠ开放阅读框。将EGⅠ成熟肽和PHO1信号肽的DNA片段插入p PIC3. 5K后,重组表达载体电转化毕赤酵母。通过甲醇诱导表达和镍柱纯化获得EGⅠ。以羟甲基纤维素钠检测活性,以肽N-糖苷酶F分析N-糖基化,以SDSPAGE分析表达情况和糖基化修饰。[结果]获得EGⅠ分泌表达菌株,诱导96 h后上清液活性为0. 513±0. 002 U/m L,纯化后的EGⅠ活性为0. 558±0. 012 U/mg。SDS-PAGE表明EGⅠ分子量在100～180 k Da,远高于预测值47. 3k Da,经肽N-糖苷酶F处理后,降至63～75 k Da。[结论]实现了EGⅠ的分泌表达,获得活性为0. 558±0. 012 U/mg的糖基化重组EGⅠ。     

长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析

从富含纤维素环境筛选获得一株纤维素降解菌株FU05,通过形态学特征及ITS序列分析确定其为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)。PCR扩增获得该菌株的bgl2、cbh2和eg1。序列分析表明,这3种纤维素酶基因与GenBank上其他木霉同种纤维素酶基因具有较高同源性:bgl2基因与里氏木霉bgl2基因(AB003110)同源性达91%;cbh2基因与康宁木霉cbh2基因(DQ504304)同源性达99%;eg1基因与长梗木霉eg1基因(X60652)同源性达95%。3种纤维素酶基因编码的相应氨基酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高。对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白进行PROSITE motif search,对其N端糖基化位点、纤维素结合区、糖基水解酶家族特征结构区等进行了定位。     

中国的肉座菌科Ⅲ.：肉座菌属的菌生种

对肉座菌属的系统分类史进行了回顾,并对３个菌生种进行了报道,其中硫磺肉座菌（新拟）Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｕｌｐｈｕｒｅａ（Ｓｃｈｗｅｉｎ．）Ｓａｃｃ．为中国新记录种,拟层孔肉座菌Ｈ．ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ Ｐ．Ｇ．Ｌｉｕ ｅｔ Ｙ．Ｄｏｉ为新种;讨论了它们与其近缘种的区别和在本属下的统分类位置。采用了全型世代特征集要分类法（ＭＴＳＣＨ）的研究方法。     

丝状真菌红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)纤维素酶基因的转录调控研究进展

红褐肉座菌(Hypocrea jecorina,即Trichoderma reesei的有性型)是工业上重要的纤维素酶生产菌株,也是用于研究纤维素酶和半纤维素酶基因转录调控机制的模式菌株。在诱导物存在的条件下,H.jecorina可以迅速启动这些糖苷水解酶基因的转录表达,但不同的诱导物对纤维素酶和半纤维素酶基因的诱导表达模式存在一定差异。目前对不溶性诱导物如结晶纤维素如何诱导这些基因的起始转录问题有3种假设;并且已发现某些参与调控纤维素酶基因转录的正调控因子(Xyr1、Ace2、Hap2/3/5)和负调控因子(Ace1、Cre1),这些调控因子可在纤维素酶基因启动子上结合且彼此间可能发生相互作用。本文系统综述了红褐肉座菌纤维素酶基因转录表达调控中的关键因素及其相互作用的相关研究进展。     

中国的肉座菌科Ⅲ.肉座菌属的菌生种

对肉座菌属的系统分类史进行了回顾,并对3个菌生种进行了报道;其中硫磺肉座菌(新拟)Hypocrea sulphurea(Schwein.)Sacc.为中国新记录种,拟层孔肉座菌H.fomitopsisP.G.Liuet     

中国的肉座菌科Ⅴ。肉棒菌属

所有保存于HMAS、HKAS和HMIGD的采自中国的肉棒菌属Podostroma标本被重新研究,鉴定出肉棒菌Palutaceum和粗肉棒菌P.grossum两个种,对这两个种重新进行了详细的描述。鹿角状肉棒菌P.cornu-damae由于缺乏可靠的标本仍存有疑问。滇肉棒菌P.yunnanensis被作为粗肉棒菌P.grossum的异名。     

中国的肉座菌科Ⅲ.*肉座菌属的菌生种**

对肉座菌属的系统分类史进行了回顾,并对3个菌生种进行了报道;其中硫磺肉座菌（新拟）Hypocreasulphurea（Schwein．）Sacc．为中国新记录种,拟层孔肉座菌H.formitopsisP．G.LiuetY．Doi为新种;讨论了它们与其近线种的区别和在本属下的系统分类位置。采用了全型世代特征集要分类法（MTSCH）的研究方法。     

水花生Actin基因片段的克隆及序列分析

肌动蛋白基因编码生物体内一种很重要的组成型表达蛋白质,常被看作看家基因。为分离水花生肌动蛋白基因,根据GenBank上一藜科植物的———Actin基因的EST序列,分别设计引物,提取水花生根的总RNA,对上述的基因片断进行RT—PCR,扩增后测序得到230bp长的核苷酸序列。经同源性比较,这条序列与上述藜科植物Actin的EST序列基本一致,表明获得了水花生肌动蛋白序列。     

亚肉座菌天然产物的分离鉴定及抗肿瘤活性

亚肉座菌能侵染粉虱和介壳虫,具有悠久的生物防治历史,但关于其天然产物的种类及抗肿瘤活性研究尚不深入。本研究借助硅胶柱、HPLC等色谱技术从亚肉座菌发酵液中分离纯化到6个化合物。基于核磁共振和质谱数据解析,化合物1–6依次鉴定为:5α,8α-表二氧-24(R)-甲基胆甾-6,22-二烯-3β-醇5α,8α-epidioxy-24(R)-methylcholesta-6,22-diene-3β-ol(1),杜斯塔宁dustanin(2),3β-乙酸基-15α,22-二羟基何伯烷3β-acetoxy-15α,22-dihydroxyhopane(3),麦角固醇ergosterol(4),7β,15α,22-三羟基何伯烷7β,15α,22-trihydroxyhopane(5)和5-(羟甲基)呋喃-3-羧酸flufuran(6),化合物1和6为首次从虫生真菌中获得。对化合物进行抗肿瘤活性测试发现,化合物1和5对人肝癌细胞(BEL-7404)展示显著的抗肿瘤活性,IC50值分别为28μmol/L和12.4μmol/L,而它们对人正常肝脏细胞(HL-7702)和肾脏上皮细胞(HEK-293T)均未呈现出明显活性。该研究对阐明亚肉座菌代谢产物及其活性提供了重要数据,为开发抗肿瘤新药提供了理论参考。     

嗜冷弧菌2693菌株的天冬氨酸转氨基甲酰酶基因克隆及测序

对嗜冷弧菌２６９３菌株编码天冬氨酸氨甲酰基转移酶的基因进行了克隆,并对其核苷酸序列进行了分析。菌株２６９３的ＡＴＣａｓｅ由ｐｒｙＢＩ操纵子ｐｙｒＢ编码催化链,ｐｙｒＩ编码调节莲。催化及调节多肽链由一条单一的双顺反操纵子编码,在同一启动基因控制之下进行转录。     

Cloning and Sequence Analysis of Genes for Cyclophilin from Arabidopsis thaliana

Two genomic DNA clones encoding cyclophilin (CyP) from Arabidopsisthaliana were isolated. The deduced protein products of thesegenes appeared to be cytosol-localized isoforms given the absenceof a specific presequence for targeting to cellular compartments.Thus, multiple CyPs may exist and function in the cytosol ofArabidopsis thaliana. ⁴Present address: Division 1 of Gene Expression and Regulation,National Institute for Basic Biology, Okazaki, 444 Japan     

西伯利亚蓼rd22基因的克隆与序列分析

以3% NaHCO₃溶液胁迫处理48 h的西伯利亚蓼为试材,利用RACE技术,从其茎部组织克隆了脱水应答蛋白RD22的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1 302 bp,5′非翻译区为59 bp,3′非翻译区为25 bp,开放读码框为1 218 bp,编码405个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域,N端含有5个重复序列THV-VGKGGV-V。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。其推演的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达到60%。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为DQ836050。     

节杆菌A．pascens DMDC12中SOD基因的克隆和序列分析

根据基因库中细菌SOD的基因保守序列和Arthrobacter pascens DMDC12的N-末端氨基酸序列设计引物,采用PCR技术,以A.pascens DMDC12基因组为模板,克隆了A.pascens DMDC12中Mn-SOD的567 bp的基因片段;再结合该基因片段和A.pascens DMDC12中SOD的N-末端氨基酸序列的有关信息,设计包含该sod完整ORF区域的引物,成功扩增了A.pascens DMDC12中Mn-SOD的基因序列,新sod序列(sodAP)已提交Gen-Bank(收录号DQ779150)。利用生物学软件对该序列进行分析表明,该sodAP序列的ORF区域全长651 bp,编码216个氨基酸;该序列和Arthrobacter sp.FB24的SOD基因序列同源性为86%。     

两个枣树扩展蛋白基因cDNA全序列的克隆及分析

用定向克隆法构建了枣树(Ziziphus jujubaMill.)快速生长初期结果枝的cDNA文库,经过重组质粒的筛选,克隆获得两个扩展蛋白基因cDNA全序列,分别命名为ZjEXP1(GenBank登录号:FJ449891)和ZjEXP2(GenBank登录号:FJ449892)。ZjEXP1全长1 037 bp,包含编码254个氨基酸的完整开放阅读框;ZjEXP2全长905 bp,包含编码251个氨基酸的完整开放阅读框。两个序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有一个组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)功能域。两者之间的氨基酸同源性为74.0%。从已知的扩展蛋白基因家族的进化分析表明,ZjEXP1和ZjEXP2由一个祖先进化而来,又分别属于两个不同的分支。     

烟草FIE和MSI1基因的克隆及序列分析

采用电子克隆与实验克隆结合的方法获得了烟草胚乳发育相关基因NTFIE和NTMSI1的cDNA序列,序列号分别为EU375458和EU375459.序列分析结果表明,这两个cDNA序列均含有完整的开放读码框,分别编码370和424个氨基酸,含有保守的WD基序.氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间FIE和MSI1基因编码氨基酸序列同源性都较高.组织表达分析结果表明,这两个基因均具有一定程度的组织表达特异性,NTFIE cDNA基因在花中的表达量最多,但在根和茎中未检测到表达,而NTMSI1 cDNA基因只在离体培养的细胞和根中特异性表达.     

Cloning and Characterization of Two Closely Linked Cellulase Genes from Cellvibrio mixtus

A 16.5-kb BamHI fragment of the Cellvibrio mixtus chromosome was found to direct carboxymethylcellulase, xylanase, and avicel hydrolysis. Two closely linked genes were subcloned from this insert. The gene, cmcI, was cloned as a 2.7-kb fragment and expressed in Escherichia coli. It encoded an enzyme of approximately 74 kDa which degraded carboxymethylcellulose and xylan but did not attack the microcrystalline cellulose substrate avicel. A second cellulase capable of degrading avicel, encoded by exoI, was found 5.5 kb downstream of cmcI. Two translation products of 53.7 kDa and 51.5 kDa were produced in E. coli strains expressing exoI. Northern analysis of total mRNA of C. mixtus grown on avicel, with a probe generated from cmcI, showed that cmcI and exoI were not cotranscribed in an operon. Received: 7 December 1995 / Accepted: 3 January 1996     

新疆3种藜科盐生植物NHX基因的克隆与序列分析比较

从新疆野生植物盐角草(Salicornia europaea)、盐爪爪(Kalidium foliatum)和盐穗木(Halostachys caspica)中分别克隆了约1.7kb的NHX基因cDNA片段,此片段均包含了NHX完整基因,三者之间有较高的同源性,盐角草NHX基因与盐爪爪NHX基因同源性达92.81%,盐角草与盐穗木同源性达92.19%,盐爪爪与盐穗木同源性达97.66%.它们与其它几种藜科盐生植物如滨藜、碱蓬、灰绿藜的NHX基因同源性也很高,达到80%以上,与拟南芥同源性也达到86%.此基因在植物尤其是藜科盐生植物中高度保守,其编码的功能性蛋白可能在影响植物耐盐中起作用.