一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统

重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体是目前较理想的基因治疗载体之一,但难以大规模制备一直是影响其广泛应用的主要因素.曾组建了一种表达2型腺伴随病毒(adeno-associated virus type 2,AAV-2) Rep和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/DUL2,现在此基础上,证实了该重组病毒支持rAAV的复制与包装,包装出的rAAV具有感染性;构建了携带新霉素抗性基因、适合多种外源基因插入的通用型rAAV载体质粒pSNAV-2及表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的rAAV载体质粒pSNAV-2-GFP,建立了稳定携带GFP基因表达盒的rAAV载体细胞株;确定了HSV1-rc/DUL2感染载体细胞株时的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.1;采用“一种病毒感染一个载体细胞株”的策略,用“感染”的方式代替传统的“转染”方式,使每个细胞产生的rAAV比传统方式提高了2个数量级以上,并实现了rAAV的规模化制备,为rAAV用于基因治疗的临床试验打下了基础.     

重组腺相关病毒载体基因表达效率与辐射的关系

重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有希望的临床应用基因治疗载体之一。rAAV载体基因传递的有效性与病毒衣壳蛋白的免疫原性之间的矛盾是制约该类基因药物开发的关键难题,提高其表达效率是rAAV载体研发的主攻方向之一。研究发现,紫外线、γ射线等辐射可以提高rAAV载体的基因表达效率,其作用效果与辐射种类和剂量、细胞种类和状态、载体感染指数和感染时间等因素有关。其机制可能与DNA损伤反应,特别是DNA双链断裂修复有关。对辐射与rAAV载体的表达效率之间关系的深入了解,为两者的联合应用打开方便之门。本文将对UV、γ射线等辐射提高rAAV载体表达效率的机制、影响因素及其在基因治疗领域的应用进展进行综述。     

降低重组腺相关病毒载体免疫反应的策略

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体在基因治疗研究中应用广泛,但可能引发机体产生免疫反应,限制了其在基因治疗领域的临床应用,如何降低rAAV载体的免疫反应已经成为基因治疗领域的研究重点之一。本文从对rAAV载体的选择和对患者免疫抑制调控两个方面介绍降低rAAV载体免疫反应的策略。     

重组腺相关病毒载体相关性杂质

可以稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒 (rAAV) 载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体内具有潜在致病危害的杂质、产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。其中针对载体相关性杂质的纯化工艺尤为关键,因为该类杂质的性质与真正的rAAV载体极其相似,一旦存在便难以去除,且会引起严重不良反应。以下总结了该类杂质形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以防止其生成或将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

1型和2型外壳蛋白构建的AAV载体携带HIV-1 gag诱导免疫反应的比较研究

比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体携带HIV-1gag基因肌肉注射诱导小鼠免疫反应的特点。分别制备携带EGFP和HIV-1gag基因的重组AAV2/1(AAV1)和AAV2载体。小鼠肌肉注射rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP,观察注射局部EGFP的表达。将rAAV1-gag和rAAV2-gag分别以0、3周初免/加强方式肌肉注射免疫BALB/c小鼠以及新西兰白兔。ELISA法检测抗HIV-1 Gag P24蛋白的特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测Gag特异性的CTL反应。结果表明,rAAV1-EGFP在小鼠肌肉的表达强度显著高于rAAV2-EGFP;用Western blot法和间接免疫荧光法检测rAAV1-gag和rAAV2-gag体外转染的293细胞,均可检测到HIV-1 Gag蛋白的表达;在小鼠体内rAAV1-gag和rAAV2-gag组均可检测到特异性P24抗体,抗体滴度rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组;而无论rAAV1-gag组还是rAAV2-gag组,特异性CTL反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24抗体,同样地,rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组。结论:携带HIV-1gag基因的rAAV1或rAAV2以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异Gag的体液免疫反应;且rAAV1可诱导很强的抗HIV-1 Gag特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2。     

重组腺相关病毒载体相关性杂质

可以稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体内具有潜在致病危害的杂质、产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。其中针对载体相关性杂质的纯化工艺尤为关键,因为该类杂质的性质与真正的rAAV载体极其相似,一旦存在便难以去除,且会引起严重不良反应。以下总结了该类杂质形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以防止其生成或将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

表达HCV包膜蛋白的两种重组腺相关病毒疫苗的制备及免疫原性分析

重组腺相关病毒载体(rAAV)可在动物体内高水平地持久表达外源基因,本研究采用两种rAAV载体(rAAV1与rAAV2)构建了表达丙型肝炎病毒中国分离株包膜糖蛋白(E1E2)的载体疫苗并以之免疫小鼠,分别采用免疫荧光证实其表达与总抗体,用HCV假病毒系统检测其中和抗体水平,用ELISpot分析其细胞免疫应答,结果表明:rAAV1-E1E2重组载体疫苗单针免疫激发的体液应答明显高于rAAV2-E1E2,rAAV1-E1E2单针注射后3个月可在肌肉组织中检出E2蛋白表达及特异性T细胞应答。上述结果提示HCV重组腺相关病毒载体疫苗单针免疫可引起明显持久的体液与细胞免疫应答。     

化学修饰的重组腺相关病毒载体

重组腺相关病毒(Recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)载体源于腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),以其无致病性、低免疫原性、可定点整合及在宿主细胞内长期表达等优势,广泛应用于肿瘤和遗传疾病等基因治疗研究,被视为最有前途的基因治疗载体之一。但是人体内广泛存在AAV中和抗体,以及rAAV对体内特定组织或细胞的靶向性欠理想,限制了其在临床上的应用。经化学修饰的rAAV可以抵御血清中和抗体,提高转导靶向性,还可实现rAAV体内动态监测,这为解决当前rAAV载体的问题提供了新的思路和方法。本文对化学修饰的rAAV展开系统阐述,并对其未来发展趋势作出展望。     

携带靶向性可调控自杀基因的重组相关腺病毒载体的构建及其活性检测

目的:构建携带受Tet-On以及VEGF启动子双调控自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体,研究其在乳腺癌细胞MCF-7中的可调控表达.方法:用PCR方法扩增VEGF启动予,将其插入pAAV/TRE/HSVtk/Tet-On中形成重组载体pAAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On质粒.进行病毒包装后得到了rAAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On重组腺相关病毒.用重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺HBL-100细胞,用MTT法及RT-PCR检测在Dox诱导下,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞和HBL-100细胞的杀伤作用以及HSVtk基因在MCF-7细胞内的表达情况.结果:在rAAV+Dox+GCV组,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞的杀伤作用明显高于rAAV+Dox组,rAAV+Dox组以及HBL-100组,并且RT-PCR结果显示经Dox诱导HSVtk表达较明显.结论:成功构建了携带双调控自杀基因的重组腺相关病毒载体,该病毒载体能有效的感染乳腺癌细胞MCF-7,并能联合GCV治疗,抑制肿瘤细胞生长,而且具有靶向性.     

重组腺相关病毒规模化生物包装技术

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)的诸多优点使其成为具有巨大潜力的人类基因治疗载体。人类基因治疗临床前和临床研究以及基因治疗产品的市场化要求rAAV载体生产的规模化。自1989年野生型的腺相关病毒序列被Samulski报道以来,rAAV的生产工艺已经从传统的质粒共转染发展到应用包装细胞系和生产细胞系,包装细胞也从"人体细胞"衍化到"昆虫细胞"。目前rAAV的生产规模和病毒载体质量都完全可以符合临床应用要求,有效地促进rAAV在基因治疗临床上的广泛运用。以下将着重介绍rAAV规模化生物包装技术的发展趋势,尤其各种规模化生产系统的要点。