陆地棉超氧化物歧化酶基因的克隆与烟草转化

以陆地棉‘中棉所36’和烟草‘NC89’为材料,采用RT-PCR方法,从陆地棉中克隆到了Cu/Zn-SOD的cD-NA编码区,经植物表达载体pBI-SOD,导入根癌农杆菌LBA4404,对烟草叶片进行遗传转化,经卡那霉素筛选,获得正确的Cu/Zn-SOD的cDNA编码区,构建了转基因载体,并成功地获得2株转基因烟草;经PCR、Southern blotting和SOD酶活性等检测,证明Cu/Zn-SOD基因已经整合到烟草的基因组并表达。本试验结果为转基因棉花的进一步研究奠定了基础。     

表达多肽抗生素apidaecin的转基因烟草及其抗病性的初步分析

将多肽抗生素apidaecin基因与病程相关蛋白的信号肽序列融合,构建了apidaecin的分泌型植物表达载体、apidaecin与另一多肽抗生素Shiva\|I的双价分泌型植物表达载体,以本实验室原来构建的Shiva-I分泌型植物表达载体做对照,转化了模式植物烟草。对3种转基因植物进行了分子检测,转化再生苗95%为PCR阳性,Southern杂交结果进一步证明外源基因已经整合到了烟草基因组中,RT-PCR检测表明外源基因可以在转基因烟草内正常转录。对T0代转基因烟草进行烟草野火病的抗病性实验,从3种转基因烟草中都得到了抗病植株,病情指数分析的初步结果显示,双价转基因烟草抗病性最好,apidaecin的次之,Shiva-I的最差。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的cDNA序列,设计合成了Ap5和Ap3两个引物,应用RT－PCR技术扩增了拟南芥的ABP基因。将该基因克隆在植物表达载体p35SSIN的35S启动子和Nos3’端之间,得到植物表达载体p35SE。通过农杆菌个导的方法对烟草SR1进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

褪黑素合成酶基因转化烟草及转化植株抗氧化系统变化

通过根癌农杆菌(含植物表达载体YXu55)介导的转化技术,将褪黑素生物合成酶-芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase,HIOMT)基因导入到烟草(秦烟95)中。对所获得的庆大霉素抗性烟草株系进行Southern blotting和RT-PCR分子生物学检测,结果表明,AANAT-HIOMT基因已成功地整合到烟草基因组中,并且可以在mRNA水平上进行转录。用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定转化株系的褪黑素含量表明,转AANAT-HIOMT基因烟草株系的褪黑素含量均明显高于pZP122(不含AANAT和HIOMT基因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株,证明AANAT-HIOMT基因在转基因植株中的表达增强了褪黑素的合成能力。对不同株系抗氧化系统的部分指标进行了测定,并与其亲本对照植株比较,发现AANAT-HIOMT基因在转基因植物中的表达引起超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性增加,谷胱甘肽(GSH)浓度...     

油葵含油量相关基因在烟草中的表达

采用RT-PCR和RACE技术从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了DGAT基因的cDNA全长序列,命名为HaDl(GenBank登录号为HM 015632).将HaDl与CaMV 35S组成型启动子融合,构建植物表达载体pBI-HaDl,通过根癌农杆菌介导转化烟草.对转基因植株进行GUS及PCR检测,同时采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析转基因烟草叶片中脂肪酸各成分的含量.结果表明:HaDl基因cDNA全长1 936 bp,最大开放阅读框为1 524 bp,编码507个氨基酸;推测的氨基酸序列与其它植物已报道的DGAT1基因的氨基酸序列一致性为70%～80%,具有DGAT1蛋白保守的二酰甘油结合基序"HKWIVRHLYFP",因此HaDl基因属于DGAT1基因家族.GUS活性染色及PCR检测均证明外源HaDl整合到烟草基因组并成功表达.转基因烟草叶片脂肪酸含量测定发现,油酸、软脂酸和硬脂酸的含量得到提高,推测HaDl是植物油脂合成相关的重要基因.     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的ｃＤＮＡ序列,设计合成了Ａｐ５和Ａｐ３两个引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了拟南芥的ＡＢＰ基因。将该基因克隆在植物表达载体ｐ３５ＳＳＩＮ的３５Ｓ启动子必Ｎｏｓ３‘端之间,得到植物表达载体ｐ３５ＳＥ。通过农杆菌介导的方法对烟草ＳＲ１进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

过表达胡杨XTH基因能够提高烟草抗旱性

胡杨是典型的抗旱树种。挖掘和鉴定胡杨的耐旱基因对于提高植物抗旱性具有重要意义。木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTH）是植物细胞壁重构过程中的关键酶,在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用。我们前期已从胡杨叶片中克隆了PeXTH基因。本文利用Real-time PCR检测PeXTH基因在干旱胁迫下的表达水平。在此基础上,构建植物表达载体pMDC85-PeXTH,通过农杆菌介导法将PeXTH基因转入烟草,分析过表达PeXTH基因烟草的抗旱性。研究发现,胡杨叶片中PeXTH基因的表达受干旱胁迫诱导。干旱处理后,转PeXTH基因烟草的萌发率明显高于野生型烟草;与野生型植株相比,转基因植株的叶片失水速率明显降低。干旱胁迫下,转基因烟草的气孔开度仅为野生型烟草的51.2%～53.6%。结果表明,过表达PeXTH基因能够提高烟草的抗旱性。本研究丰富了对胡杨PeXTH基因功能的认识,为植物抗旱分子育种提供了重要的基因资源。     

Vip3a基因植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化

为了研究Vip3A基因在转基因抗虫植物中的应用,利用PCR技术克隆了苏云金芽孢杆菌的Vip3A基因和烟草的EF1α启动子,以pB1121质粒为基本载体,构建了分别由组成型CaMV35S启动子和花特异表达的EF1α启动子驱动Vip3A基因的植物表达载体pBIVip3A和pBIEFVip3A,并通过农杆菌介导的方法对烟草进行了遗传转化。经PCR检测,外源基因已整合到烟草基因组中。     

陆地棉叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与表达

以陆地棉‘CRI36＇的叶片为材料,使用RACE技术克隆到了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD酶基因。基因序列全长共1 043 bp,含有完整的开放阅读框。推导的氨基酸序列分析显示含有叶绿体信号肽,和已知植物的叶绿体Cu/Zn-SOD酶蛋白的氨基酸残基的同源性在66%～74%之间。基因的表达谱分析显示：棉花叶绿体Cu/Zn-SOD酶基因主要在叶片、茎中表达,根、花和下胚轴中没有检测到信号,即基因的表达主要在棉花的绿色组织。不同生育期的表达谱结果证实：该基因主要在苗期表达,以后表达逐渐减少。用pET-21a（＋）构建了原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）的表达结果显示：表达后得到一个29.0 kD的新蛋白,其分子量与预期目标一致。对SOD酶活性的分析证实,重组菌的酶活性显著增加,证明克隆的基因具有活性。     

CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

本研究的目的是将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中,利用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中,PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

HIV-1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体.脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞.结果表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验.     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。     

HIV—1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES－KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV－1辅受体的配体,趋化因子RANTES和SDF－1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体。脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实了RANTES和SDF－1可高效表达于HeLa细胞。细胞表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV－1感染实验。     

Expression of Concern

“MiRNA‐218 regulates osteoclast differentiation and inflammation response in periodontitis rats through MMP9”, Cell. Microbiol. 2019;21:e12979, by Jie Guo, Xuemin Zeng, Jie Miao, Chunpeng Liu, Fulan Wei, Dongxu Liu, Zhong Zheng, Kang Ting, Chunling Wang, and Yi Liu. The Editors of Cellular Microbiology and the publisher John Wiley & Sons agree to publish an Expression of Concern regarding the above article, published online in Cellular Microbiology on November 16, 2018, in Wiley Online Library ( https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/cmi.12979 ). In September 2019, the journal was contacted regarding concerns about the data presented in Figures 6 and 7 because of high level of similarities in the graphs presented in these figures. The different bars in the graphs show identical height. The standard deviation bars are also of identical length. Although one graph expresses the number of TRAP‐positive cells (Figure 6b) and the other graphs express the relative mRNA expression of different osteoclast‐related genes (Figure 6c‐g), all graphs are identical. The bars in the graphs in Figure 7 that represent 5 different osteoclast genes show the same height. Figures 6 and 7 show identical mRNA expression for a series of different genes: V‐ATPase, NFATc1, CTSK, DC‐STAMP and TRAP. In December 2019, the journal requested the authors to provide the raw data of the experiments presented in the article and for explanations of the similarities. The authors responded that the similarities were due to unintentional errors and provided Excel spread sheets containing processed data in March 2020. The data provided in the Excel sheets that were sent by the authors were analyzed and it was concluded that the calculations as shown in the Excel sheets are correct. However, the concerns raised regarding similarities in the heights of bars representing different parameters and narrow range of standard deviations presented in Figures 6–7 remained. The authors disagree with the concerns raised. In addition, the editors were concerned by manipulations of western blot images to represent single bands instead of doublets for COL1 in Figures 5 and 8 and for MMP9 in Figures 3A and C, 4C, 5A and D, and 8A. The first issue concerning COL1 bands has been addressed and corrected during the peer‐review process. The latter has been clarified after publication and following a request from the editors for the raw data of all figures in the article. In the published article, western blots of MMP‐9 in Figures 3A and C, 4C, 5A and D, and 8A show active‐MMP‐9 only and do not include pro‐MMP‐9 bands that were present in the original western blot experiments. The authors explained that on the original blots that were provided during the peer‐review process, MMP‐9 show doublets that represent pro‐MMP‐9 and active‐MMP‐9. As no significant difference was found for pro‐MMP‐9, the authors only presented single bands for active‐MMP‐9 in the publication version. The authors’ institution, Shandong University, did not respond to a request from the Publisher and the Editor‐in‐Chief to investigate whether the data arose from the originally reported experiments, are unmodified, and are suitable for publication. As a result, the journal is issuing this expression of concern to readers.