农杆菌介导籼稻优良恢复系bar基因的遗传转化研究

应用农杆菌介导转化体系,成功地将含有CaMv35s启动子启动的bar基因导入籼稻幼胚来源的愈伤组织,获得籼稻优良恢复系T461、R402和752三个品种（系）共47个抗除草剂Basta的转基因株系,Southem分析结果表明,转基因植株基因组中检测到bar基因的整合,转基因植株自交后代Basta除草剂抗性鉴定表现出分离,且大多数为1-2个整合位点的孟德尔方式遗传。结果表明,根癌农杆菌介导法可以有效且可靠地转化籼稻。     

拟南芥ICE1基因转化水稻的进一步研究

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将由启动子（35S和rd29A）调控的拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中。潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传;抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照;脯氨酸含量测定结果表明,低温处理后T1代植株脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照;上述结果表明,转ICE1水稻提高了抗寒能力。     

根癌农杆菌介导的油菜基因转化研究进展

对根癌农杆菌介导的油菜基因转化研究中的几个关键因素及进展作了综述,并对目前存在的问题进行了分析。     

农杆菌介导的植物基因转化研究进展

农杆菌介导的植物基因转佛当今植物基因转化的主要方法之一,因而深受关注,本文从农力介导的基因转化机理,植物对农杆菌侵染的反应,转基因植物的遗传表达,以及农杆菌对单子叶植物的转化等方面论述了该领域的最新研究进展,并提出了进一步研究的方向。     

农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转GsZFP1基因研究

以亚洲百合‘耀眼’(Cedeazzle)无菌苗小鳞片为遗传转化受体,并利用农杆菌介导法将锌指转录因子基因GsZFP1转化‘耀眼’无菌苗小鳞片,初步建立亚洲百合‘耀眼’的遗传转化体系,通过筛选获得了50株疑似转化植株,通过用PCR方法对获得的50株疑似抗性植株进行检测,结果显示20株呈阳性,PCR阳性转化率为40%;将得到的阳性植株进行RT-PCR检测,获得12株RT-PCR阳性植株。结果表明,锌指转录因子基因GsZFP1在亚洲百合‘耀眼’中得到表达。     

拟南芥ICEl基因转化水稻的进一步研究

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将由启动子(35S和rd29A)调控的拟南芥ICEI基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中.潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传;抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照;脯氨酸含量测定结果表明,低温处理后T1代植株脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照;上述结果表明,转ICEl水稻提高了抗寒能力.     

农杆菌介导的转谷氨酰胺合成酶基因小麦的抗除草剂特性研究

 谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS,E.C. 6.3.1.2）是植物氨同化过程中的关键酶,对植物的氮素吸收和代谢起着至关重要的作用。谷氨酰胺合成酶还是除草剂草胺膦(Phosphinothricin　(PPT)或Basta)的靶标酶。前期工作已从我国特有的豌豆(Pisum satium)品种中克隆了细胞质型谷氨酰胺合成酶（GS1）cDNA和叶绿体型谷氨酰胺合成酶（GS2）cDNA。为了验证谷氨酰胺合成酶的功能,构建了同时含有GS1 cDNA和GS2 cDNA的植物表达载体p2GS。以该表达载体通过农杆菌介导法,转化小麦(Triticum aestivum)的未成熟胚愈伤组织,经PPT筛选及分化再生培养,获得了抗PPT的转基因小麦植株41株。PCR和基因组Southern 杂交分析证实了GS1 和GS2基因已经整合到转基因小麦的基因组。用除草剂草胺膦Basta溶液涂抹转p2GS小麦叶片,结果证明GS转基因植株可以抗高达0.3%的 Basta溶液,而对照植株叶片逐渐变黄直至枯死。转基因小麦植株能正常结实。上述实验结果表明：1) GS基因在小麦植株中获得了有效表达,从而赋予小麦植株抗PPT特性;2) GS基因能够作为研究小麦遗传转化的筛选标记基因。     

农杆菌介导棉花大规模高效转化体系的研究

对农杆菌介导法转化棉花技术体系进行了综合改进,突破基因型的限制,使多品种或基因型(10个以上)的我国主栽棉花品种(系)转化成功,其中中棉所24号发展成为快速模式化转化品种(转化周期5～7个月,转化率8．1％),CCRI27、CCRI36等多个品种转化体系基本成熟。不同转化体系的愈伤组织诱导率为10％～40％,愈伤组织胚性愈伤诱导率达到10％～40％,转化率总体平均达到1．8％,并对大批量再生苗的鉴定予以程序化。实现棉花转基因规模化,达到年产转基因棉花植株2000～4000株以上的水平。     

杉木高效再生与基因转化的初步研究

用取自60d龄无菌苗上的杉木茎段为外植体,在MS 6-BA0.75mg/L IBA0.25mg/L培养基中诱导芽分化,丛生芽的诱导率达到95.8％,每个外植体平均有5.2个芽。切取诱导芽单苗,转至MS NAA1.0mg/L培养基上诱导根再生,外植体出根率为91.4％。在此基础上,将杉木茎段与农杆菌AGL1共培养2d,通过在含200mg/L卡那霉素的再生培养基中培养,初步筛选出卡那霉素抗生苗,转化频率为1.1％。     

罗汉果主要性状遗传效应研究

罗汉果近交后代发生明显衰退,花和果变小甚至畸形,种子活力降低,品种间衰退速度不同;杂交F_1后代果实形状、大小、颜色、总苷含量、甜苷Ⅴ含量和雌花柱头生长方式产生严重分离变异,其中果实大小、总苷含量、甜苷Ⅴ含量表现出明显杂种优势;雄性败育系的花粉败育是由遗传决定的,其败育性可通过杂交传递给雌性系产生无籽果实;F17芽变枝条所得雌雄同花两性突变属于遗传变异。     

无籽罗汉果选育的初步研究

采用多倍体诱导、不同倍性配子杂交和组织培养等技术方法,培育出三倍体无籽罗汉果新种质类型。通过与当前罗汉果主要品种的对比栽培实验和观测,表明无籽罗汉果优良株系花、叶等器官形体较大,植株长势健旺,现蕾开花较早,果实无籽或极少籽,甜苷Ⅴ含量比其母本提高36.28%。其生物学性状的变化,尤其是甜甙含量的提高和抗性的增强,表现出了重大的开发利用价值。就无籽罗汉果的生育周期、形态特征、生长发育规律以及果实品质进行初步报道。     

用单性结实基因2A11-iaaM转化罗汉果的研究

为了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化,该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因(2A11-iaaM)过量表达载体,以罗汉果雌株叶盘为材料,采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系,转化和创制单性结实罗汉果种质,通过基因特异引物对的PCR扩增,初步检测出转基因阳性植株,将之移栽大田,观察转基因植株的单性结实性的表现。结果表明:构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系,即农杆菌菌液OD_(600)值为0.3～0.5,侵染10 min,最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg·L~(-1)+IBA 0.5 mg·L~(-1)+Kan 5 mg·L~(-1)+Cef 300 mg·L~(-1);经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间,经田间调查发现,24株阳性扩繁植株中有5株正常开花,占总植株数的20.8%,且其子房未经人工授粉发育成幼果,表现单性结实性。在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上,将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达,为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理,创制转基因罗汉果单性结实新种质,以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础。     

罗汉果组培苗生物学特性研究

对罗汉果组培苗生育周期、生长发育习性以及生态适应性进行观测,结果表明:年全生育期为240～260d,定植当年即可正常开花结实。根系与块茎有两个增长高峰期,分别为开花结果期(7月上、中旬)、枯苗期(11月上旬～12月上旬);茎蔓在定植20d内生长较缓慢,之后逐步加快,其中主蔓和一级侧蔓构成植株空间骨架结构,二级侧蔓和三级侧蔓为主要结果蔓;开花座果盛期在7月下旬至8月中旬,花、果着生位置以二级侧蔓的6～15节和三级侧蔓的3～18节为主,点花授粉宜在雌雄花开放的当天上午进行,果实的生长膨大约在座果后的30d内完成,但果实发育成熟约需80d。生长发育的适温为22～28℃,其中旬温25～28℃时对花果生育最为适宜;生长过程中应保持土壤湿润和80%以上的空气湿度;全生育期对氮和钾的吸收量较大,但在生殖生长期,尤其在结果盛期与果实发育期,对磷、钾的需求增加。     

罗汉果组培繁殖的技术要点

报道罗汉果组培繁殖的各项主要技术要点,包括组培条件、培养基的配制、外植体的选取与消毒、接种与培养、种源保存、炼苗与移栽、苗木包装与运输等。提出了5种培养基参考配方,即茎段诱导培养:MS+BA0.5～1.0mg/L+IAA(NAA)0.05～0.1mg/L+白糖3%+琼脂4.5g/L,pH5.8;茎尖诱导培养:MS+BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+椰子水100mL+白糖3%+琼脂4.5mg/L,pH5.8;继代培养(丛生芽方式):MS+BA0.3～0.7mg/L+NAA0.05/IAA0.1mg/L+白糖3%+琼脂4.5mg/L,pH5.8;继代培养(微型扦插方式):MS+BA0.1mg/L+IAA0.3mg/L+活性炭0.07g/L+白糖3%+琼脂4.5mg/L,pH5.8;生根培养:MS+BA0.07mg/L+IBA0.15mg/L+IAA0.1mg/L+活性炭0.1g/L+白糖3%+琼脂4.5mg/L,pH5.8。分析了外植体培养过程中可能出现的不良状况的原因并提出预防措施,明确了炼苗移栽的适宜条件并制定出相应的管理方法。形成了一套较为完整的罗汉果组培苗繁殖生产技术规程。     

罗汉果SRAP反应体系的建立与优化

建立适合罗汉果的SRAP-PCR扩增体系,为罗汉果的遗传图谱构建及基因定位奠定基础。实验对罗汉果SRAP-PCR反应体系的影响因素(引物,dNTP,Taq酶,Mg~(2+),模板DNA)在多个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了罗汉果SRAP-PCR反应的最佳体系(10μL):引物0.6μmol/L、dNTP0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、Mg~(2+)2.0 mmol/L和模板DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足罗汉果基因组DNA的扩增要求,SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。     

不同波长光照对罗汉果光合及生长影响

罗汉果试管苗在不同波长的LED(半导体)蓝(475±5nm)、黄(585±5nm)、红(660±5nm)及普通日光灯下培养,25d后观测发现,其外观的优劣依次为:蓝光>白光>红光>黄光;植株重量:蓝光>红光>黄光>白光;蓝光和白光下的植株叶大、色绿,植株矮壮,侧芽多;红光和黄光下的植株叶小、色黄绿,植株高、细、弯曲、节间长。测定罗汉果成熟叶片的吸收光谱,发现在波长380~500nm及660~680nm处有较强吸收。不同的光质下测定成熟叶片光合速率,大小依次为:红光>蓝光>白光>黄光。上述的各项试验表明,蓝光对罗汉果幼苗生长发育最好;红光和蓝光为成熟叶片光合作用的最佳光源。     

不同遮荫处理罗汉果内在品质的变化研究

以罗汉果‘永青1号'品种为试验材料,在授粉30 d后,设置不遮荫、遮荫70%、遮荫95%三个处理,探讨遮荫对罗汉果总苷、总糖、维生素C等内在品质的影响。结果表明:在授粉30 d后,对罗汉果进行一定程度的遮荫处理,显著提高了罗汉果果实重要内含物总苷、甜苷Ⅴ、总糖和维生素C的含量,可有效改善罗汉果果实的内在品质。遮荫70%处理条件下较适宜罗汉果果实内含物的累积。     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

罗汉果不同溶剂提取物抗氧化及清除活性氧自由基作用

以水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯为溶剂,对罗汉果干果进行提取,分别采用磷钼酸铵体系、邻苯三酚自氧化体系、Fenton反应体系和卵黄脂质过氧化体系测定各种提取物的总抗氧化性能、超氧阴离子自由基和羟基自由基清除性能及其抗脂质过氧化作用。结果表明,四种溶剂提取物均具较强的抗氧化性和活性氧自由基清除性能,其能力的大小顺序为:乙酸乙酯提取物>水提物>甲醇提取物>乙醇提取物。