萘质粒转移到大肠杆菌中合成靛蓝的研究

利用含有萘降解质粒的假单胞菌,通过接合和转化,把这种质粒转移到大肠杆菌中,获得接合子和转化子。这种接合子和转化子不仅在L-培养基中能合成靛蓝,而且能在以萘作唯一碳源和能源的培养基中生长繁殖。因此,本工作不仅为微生物合成染料开拓新的途径,而且对研究环境有毒污染物降解菌的遗传工程也具有一定的意义。     

萘降解质粒ND1.860和NAH7的DNA同源性研究

通过DNA:DNA杂交技术,用NAH7质粒的全部EcoR Ⅰ片段或ECOR Ⅰ A片段作为~(32)P标记的DNA探针,研究了萘降解质粒ND1.860和NAH7之间的DNA同源性。在ND1.860的9个HindⅢ片段中,5个与NAH7有同源性,其中3个与NAH7的编码萘降解途径的EcoR Ⅰ A片段有同源性。     

通过接合作用质粒从大肠杆菌到棒状杆菌的转移

构建了可接合转移的穿梭质粒pXZ911、pBZ51和pBZ52。这些质粒中含有具转移功能的Mob片段和在棒状杆菌中复制的复制区。以大肠杆菌S17—1为供体菌,通过接合转移作用,可将这些质粒转移到谷氨酸棒杆菌ATCCl3032、谷氨酸棒杆菌ATCC21543、北京棒杆菌B3、北京棒杆菌1．299、裂氏棒杆菌B43、黄色短杆菌ATCC 14067等棒状杆菌苗株,接合转移频率分别为：9X10^-5,1X10^-4,8．5x10,2．3X10^-4×10^-5,2．9X10^-5。本文还探索了大肠杆菌和几种革兰氏阳性棒状杆菌问基因转移的方法、转移频率、影响转移频率的因素、宿主范围等问题。     

低能氮离子注入大肠杆菌诱发的生物学效应研究

研究离子注入的诱变和导入外源DNA的生物学效应,用低能氮离子注入处理大肠杆菌野生型菌株MC4100A,将含水母绿色荧光蛋白基因的质粒导入细胞中。实验结果表明,在一些转化子中绿色荧光蛋白的表达或折叠受到了影响,一些转化子丧失了分裂后分离能力,且细胞膜有一定程度的损伤,为进一步研究微生物细胞分裂和蛋白质折叠机理提供了菌株。故低能氮离子注入对微生物细胞的诱变效应和导入外源DNA效应的有机结合将使离子注入技术在生物学基础研究中有着广泛的应用前景。     

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA转化大肠杆菌的操作方法.采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞.以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth和植物双元表达栽体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1.质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后,直接涂布含有筛选抗生素的LB平板,于37℃培养12～16h.结果表明,用不同大小的质粒DNA转化不同的大肠杆菌菌株,都可以获得满足实验要求,转化效率可高达103～4阳性克隆/μg.该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用.     

肠聚集性大肠杆菌质粒的研究

本文介绍了肠聚集大肠杆菌（ＥＡｇｇＥＣ）质粒的同源性与质粒ＤＮＡ探针,质粒对粘附等特性的介导以及质粒ＤＮＡ的基因结构等的研究现状。     

外源质粒（基因）导入花生根瘤菌的行为分析

利用二亲本或三亲本杂交的方法,将携带有共生固氮基因的外源重组质粒或外源载体质粒导入慢生型花生根瘤菌［Ｂｒａｄｙｒｈｚｏｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］１４７－３和快生型花生根瘤菌［Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］８５－７中。探讨了转移接合子中外源质粒在人工培养条件下和共生条件下的稳定性,发现外源质粒在花生根瘤菌中的稳定性与质粒的类型、受体菌的特性和环境条件有关。同时还探讨了外源质粒上的共生基因对受体菌１４７－３共生固氮效率的影响。结果表明,外源共生基因对共生固氮能力的影响是复杂的,既可以产生正效应,也可以产生负效应。     

Ri质粒转化番茄的初步研究

作者利用具Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)PRi 15834,PRiA4和PRi2659,对番茄不同品种的不同外植体进行转化试验。在感染部位诱导出毛状根和再生植株,经检测毛状根及再生植株均含有农杆碱和甘露碱。比较不同菌种诱导毛状根的频率和在不同番茄品种间差异。结果表明:发根农杆菌PRi15834和PRiA4感染番茄诱导毛状根的频率比PRi2569诱导频率高。供试番茄品种中强力米寿和粉白砂,感染效果最好。感染方式以叶盘法和胚轴的直接注射法比较适宜。     

萘质粒ND1.860HindⅢ片段的分子克隆和限制酶图谱

萘质粒ND1.860经限制性核酸内切酶HindⅢ完全消化和部分消化所产生的限制片段,分别在大肠杆菌质粒pBR322中克隆。通过对含有ND1.860HindⅢ片段的17个重组质粒进行限制酶分析,建立了ND1.860质粒的HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ种内切酶26个切点的酶切图谱。     

质粒RSF1010从大肠杆菌到稀有放线菌头状链轮丝菌和星状诺卡氏菌的接合转移

１９８７年,ＴｒｉｅｎＣｕｏｔ等人［１］证明穿梭质粒可以在革兰氏阴性的大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）和多种革兰氏阳性细菌之间发生接合转移。在这种转移中质粒需具备大肠杆菌的复制起始位点,同时又具备革兰氏阳性细菌的广宿主范围复制起始位点。转…     

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究

成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNH^M(Kan^r),研究了重组质粒pETNH^M在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNH^M具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNH^M具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNH^M以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。     

质粒在大肠杆菌和链霉菌和FR-008之间的属间接合转移

tIJ8154是由链枪菌一大肠杆菌双功能穿梭载体pGM160衍生而来的．本文报道这个质粒从携带RP4的大肠杆菌细胞中向革兰氏阳性细菌一链霉菌FR-008中的转移．从两种宿主中分别提取质粒DNA,进行琼脂糖凝胶电泳,发现pIJ8154的结构在两种亲缘关系甚远的宿主中均是稳定的,这种接合转移的方法已经成为向链霉菌FR-008中转移基因的一种手段．     

苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌穿梭质粒的构建和特性研究

将苏云金芽孢杆菌中的pHTA1030质粒与大肠杆菌中的pJH101质粒重组后,构建出pBHGA重组质粒。此质粒通过逐步酶切,缺失后重组得到了14个分子量大小不同的衍生重组质粒。经过对pBHG1重组穿梭质粒在E.coli HB101和B.subttlis 168受体中表达的分析,证明了它带有B.thuringiensis(简写作B.t.)质粒的启动区、启始复制区和对热分离稳定区基因片段,并能高频转化B.t.受体细胞和高表达外源cat基因,同时具有对热分离稳定的特性。为B.t.基因工程体系提供了高效转化表达载体。     

一种含双歧杆菌种属特异性复制子的新型大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒的构建

目前,双歧杆菌的转化是一个技术难题,与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同,采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此,本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有"种属特异性"要求,并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型穿梭质粒,以求解决这一难题.首先从GenBank获取长双歧杆菌隐性质粒pMB1的序列信息,采用Overlap-PCR方法获得其全长DNA,作为拟构建质粒的复制子;继而采用重组技术,将其与pMK4质粒片段(含大肠杆菌复制子pUC和抗氯霉素基因Cat)重组,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒;用电穿孔法将重组质粒转化双歧杆菌,通过观察不同电转参数下的转化效率,选择双歧杆菌转化的最佳条件.结果,成功获得全长1899bp的pMB1复制子并构建成功含有pMB1和pUC双复制子的原核重组质粒,经酶切和测序鉴定正确,命名为pCMB1.以重组质粒成功转化了长双歧杆菌NCC2705和NQ1501,而其它3种野生型双歧杆菌(包括1株长双歧杆菌)未能转化成功.结论:质粒中含有双歧杆菌种属特异的复制子是实现双歧杆菌转化的必要条件;即使是含有特异复制子的质粒也只能转化有限数量种型甚至有限数量种株的双歧杆菌;选择最佳电转化条件能显著提高转化效率.     

发根土壤杆菌Ri质粒对黄瓜进行遗传转化的研究

以发根土壤杆菌Ｒｉ质粒介导,对载体ｐＢＴＣ－８上的Ｔ－ＤＮＡ转化黄瓜进行了初步研究。采用黄瓜的各种不同外植体片断与土壤直菌共培养的方法,诱导出具有典型毛状根特性的转化根,转化根经诱导培养形成愈伤组织,冠瘿碱检测表明,转化根及愈伤组织含有农杆碱和甘露碱。愈伤组织进一步分化培养再生出完整植株。再生植株表现卡那霉素抗性。     

外源质粒电击转入Pseudomonas putida的条件研究

以自行筛选的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）(命名为Rs198,Genbank登录号为FJ788425）为受体菌,将具有卡那霉素抗性标记的大肠杆菌假单胞菌穿梭质粒PDSK519通过电转化法导入到受体菌中,对细胞生长状态、电转化温度、质粒DNA及感受态细胞浓度、电击电压及电转化介质给予转化效率的影响进行研究。结果表明,在细胞生长至OD600为0.5左右时收集菌体,在低温条件下制备浓度为 4.6×1012/ml 的感受态细胞,以0.3mol/L的蔗糖为电转化介质,在13kV/cm的场强下电击能获得较高的转化效率,最高可达1.3×107个转化子/μ g DNA。为构建恶臭假单胞的遗传转化系统,利用基因工程手段为该菌的进一步研究奠定了理论基础。     

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。