蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH和Holo-GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH的“熔点”为62.5℃,兔肌Apo-GAPDH的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH小得多,蛇肌Apo-GAPDH活力损失一半的时间(t_(1/2))为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH小32倍,兔肌GAPDH小165倍,但蛇肌GAPDH仍比兔肌GAPDH稳定。蛇肌GAPDH与兔肌GAPDH的最适pH相同,pH稳定性蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH的pH稳定范围在pH6.1～8.1。ATP在0℃也引起蛇肌GAPDH失活,失活速度比兔肌GAPDH小。结果表明蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH 和Holo-GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 的“熔点”为62.5℃。C,兔肌Apo-GAPDH 的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH 的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH 小得多,蛇肌Apo-GAPDH 活力损失一半的时间(t_(1/2)为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH 小32倍,兔肌GAPDH 小165倍,但蛇肌GAPDH 仍比兔肌GAPDH 稳定。蛇肌GAPDH 与兔肌GAPDH 的最适pH 相同,pH 稳定性蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH 的pH 稳定范围在pH6.1～8.1。ATP 在0℃也引起蛇肌GAPDH 失活,失活速度比兔肌GAPDH 小。结果表明蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

不同氮水平下冬小麦叶绿体中甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的变化

NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(E.C.1.2.1.13,缩写为G-3-PDH)是卡尔文环中催化光合最初产物3-磷酸甘油酸(3-PGA)还原成3-磷酸甘油醛的关键调节酶,反应如下:     

水稻叶绿体中GAP脱氢酶、FBP酶和醛缩酶的比较研究

光合作用同化二氧化碳的碳素循环(即卡尔文环)所生成的糖磷酯,主要从环中的两个反应步骤向环外转移,这两个酶促反应是由甘油醛-3-磷酸脱氢酶(简称GAP脱氢酶)和果糖-1,6-双磷酸酯酶(简称FBP酶)催化的,即在固定二氧化碳后,由FBP酶、GAP脱氢酶和醛缩酶的作用,将卡尔文环的产物     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶结构的保守性

对中国南海龙虾等五种种属的甘油醛－３－磷酸脱氢酶晶体结构进行了比较,结果显示该酶三维结构的高度保守性。结构类似性包括酶活性中心、与辅酶结合部位、二级结构、结构域组织、亚基排列以及许多有序水结构。位于分子中心的Ｓ－ｌｏｏｐ区存在两种略有差别的构象,分别对应于耐热酶与不耐热酶。对其它细小的结构差别也进行了分析与讨论。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。     

龙虾甘油醛-3-磷酸脱氢酶结构中的氢键

甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）是一种具有别构作用的寡聚酶。根据Ｘ射线晶体学研究得到的中国南海龙虾Ｐ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒｈｏｌｏ－ＧＡＰＤＨ高分辩率三维结构显示复杂的氢键结构,对各种类型氢键的分布和几何性质进行了统计分析。这个寡聚蛋白氢键的特性总体上与单体蛋白类似。几乎所有位于亚基间界面的极性侧链都能形成氢键,并满足能量上有利的几何学要求     

叶绿体中依赖NAD(P)H的甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的测定

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下简称GAP脱氢酶)是叶绿体卡尔文环中的一种重要的调节酶,它是卡尔文环中唯一利用由光系统Ⅰ产生的还原能力(NADPH),催化光合作用的最初产物3-磷酸甘油酸(3-PGA)还原成3-磷酸甘油醛,反应如下:     

龙虾D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶四方晶型结构

用座滴汽相扩散法培养出龙虾(Palinurus versicolor)D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(holo-GAPDH)的四方型晶体,空间群为P4212,晶胞参数为a=15.49nm,c=8.03nm,不对称单位含两个亚基.应用分子置换法测定了0.34nm分辨率晶体结构.最后的晶体学Rfree和R因子分别为0.274和0.262,与标准键长和键角的均方根偏差分别为0.002nm和2.33°.不对称单位的两个亚基不仅三维结构相似而且平均温度因子也接近,这一结果说明以前报道的C2晶型中亚基平均温度因子的显著差别很可能是由于两个亚基处于不同的晶体学环境引起的,进一步支持了holo-GAPDH分子具有良好的222对称性.     

迟缓爱德华氏菌中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌调控

【目的】迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中关键酶之一,前期研究证实是一种广谱性抗原,可作为水产养殖细菌病免疫防治中疫苗的开发靶点。本文探究迟缓爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的胞外分泌机制。【方法】通过Western blot和ELISA方法考察迟缓爱德华氏菌经典分泌系统缺失株GAPDH胞外分泌情况;使用ELISA方法对迟缓爱德华氏菌突变体文库的GAPDH胞外分泌进行了大规模筛查,并结合q RT-PCR对筛查得到的插入失活株进行了表达分析。【结果】经典分泌系统与GAPDH的胞外分泌存在一定相关性。突变体文库的大规模筛查得到两株GAPDH分泌量明显增加的插入失活株Δesr A和Δesr C,这两个基因的失活会导致GAPDH的胞外分泌量显著上调。【结论】迟缓爱德华氏菌GAPDH的胞外分泌受Esr A和Esr C负调控。     

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶共表达对蓝藻光合作用效率的影响

以转高等植物ALD和TPI基因的鱼腥藻 7120为对象 ,研究了ALD和TPI两个酶表达量对细胞光合固碳效率的影响。考察了初始pH、NaHCO₃浓度和CO₂浓度对转基因藻和野生藻生长、光合活性及无机碳亲和力的影响。结果表明 ,转基因藻在较高碳源浓度下 ,其生长速率和光合放氧活性比野生藻有显著的提高 ,并且可以比野生藻耐受更高的pH。在含有2%CO₂的空气中 ,转基因藻对外源无机碳的亲和力比野生藻提高了4.06倍.     

逆境胁迫下甘油醛-3-磷酸脱氢酶功能多元化的研究进展

糖酵解是动植物以及微生物细胞中葡萄糖分解产生能量的共同代谢途径,而甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为糖酵解途径中的一种关键酶,被认为是只存在于细胞质中的管家基因产物。但近年来的研究表明GAPDH mRNA和蛋白质水平会随着各种环境因素的影响而发生变化,并具有不同的亚细胞定位以及多元化的生理功能。本文综述逆境胁迫下GAPDH在不同生物体细胞中的不同功能的相关作用机制。     

拟南芥胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达模式分析

[目的]研究拟南芥胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;At GAPDH)基因家族成员的生理功能和表达模式。[方法]利用生物信息学法分析At GAPDH1和At GAPDH2的启动子元件;借助序列克隆、植物转基因技术、以及GUS活性检测技术分析At GAPDH1和At GAPDH2在植物内表达模式。[结果]启动子序列生物信息学分析表明At GAPDH1和At GAPDH2启动子分别具有相同的和基因特异的调控元件;启动子融合GUS活性检测表明At GAPDH1和At GAPDH2具有不同的表达模式。[结论]通过对At GAPDH基因家族成员的表达模式的分析,初步确定了基因家族成员功能的特化与其序列和表达模式的相关性。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅰ.纯化和一些基本性质

用硫酸铵分级、DEAE-纤维素柱层析、羧甲基纤维素柱层析分离和纯化了蛇肌GAPDH。聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳均为一条带。用此法提纯的蛇肌GAPDH A_(280)/A_(260)为2.1,是Apo-GAPDH。在纯化的Apo-GAPDH中加入NAD~ 能够得到结晶。Sephadex G-150凝胶过滤法测得蛇肌GAPDH的分子量约为150,000。十二烷基硫酸钠凝胶电泳也为一条带,亚基分子量约为38,000。表明蛇肌GAPDH是由相同的四个亚基组成的。用Ferdinand法测得比活为100。蛇肌GAPDH的N-末端氨基酸为缬氨酸。每分子含巯基数、色氨酸和酪氨酸残基数分别为12、12和36。重量法测得蛇肌Apo-GAPDH消光系数E_(280)~(0.1%)为0.775;Holo-GAPDH的消光系数E_(280)~(0.1%)为1.02。蛇肌GAPDH对甘油醛-3-磷酸的米氏常数为1.67×10~(-3)M,对NAD~ 的米氏常数为1.11×10~(-4)M。NAD~ 与蛇肌Apo-GAPDH结合后有Racker带,每分子蛇肌GAPDH可结合4分子NAD~ ,酶与NAD~ 的结合表现为负协同性。蛇肌GAPDH的圆二色谱,近紫外区Apo-GAPDH在285nm处有一负峰,292nm、270nm处有肩。加入NAD~ 后负峰变大并且蓝移。NAD~ 的加入似乎影响了酪氨酸所处的微环境。远紫外区Apo-GAPDH在220nm处有一负峰,208nm处有一个肩;加入NAD~ 后,负峰值稍稍变大,但峰的位置和形状未变。表明蛇肌GAPDH中,含较多的β-折迭,较少的α-螺旋。NAD~ 的加入对二级结构影响不大。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶与辅酶类似物ATP及底物磷酸结合特性的晶体学研究

气相扩散共晶生长法培养出Ｐ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ龙虾肌ＡＴＰ－Ｄ－甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＡＴＰ－ＧＡＰＤＨ）的晶体。用同步辐射Ｘ光源－磷光储屏－Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇ照相机系统收集了一套２．０分辨率的衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了其结构。精化后的结构模型最终Ｒ因子为０．１９７,与标准键长、键角的均方根偏差为０．０１６°和３．２０°。ＰｖＡＴＰ－ＧＡＰＤＨ结构总体上和Ｐｖａｐｏ－ＧＡＰＤＨ相似。ＡＴＰ分子的占有率较低,并表现出一定程度的无序性,提示ＡＴＰ与酶蛋白结合的稳定性较低,表明ＮＡＤ＋的尼克酰胺核苷部分与蛋白质分子的作用在辅酶与蛋白质的稳定结合中起关键作用。ＡＴＰ－ＧＡＰＤＨ中每个亚基只有一个磷酸结合位点（Ｐｉ）。认为无机磷酸结合位点Ｐｉ的形成不依赖于ＮＡＤ＋,而底物磷酸结合位点ＰＳ的形成则依赖于ＮＡＤ＋的存在。     

高羊茅甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因FaGAPDH的克隆与分析

以高羊茅茎基部与叶基部的mRNA为模板,引用基于多年生黑麦草GAPDH基因序列设计的引物,进行RT-PCR分析,同时结合3'RACE和5'RACE方法从高羊茅中扩增出两个GAPDH基因,命名为Fa-GAPDH1(GQ480772)与FaGAPDH2(GQ480773)。两序列cDNA全长分别为1281bp和1348bp,具有完整的开放阅读框(ORF,FaGAPDH1:74～1087bp;FaGAPDH2:106～1119bp),编码蛋白都为337个氨基酸。保守结构域功能分析表明两基因编码的蛋白质都具有典型的Rossman-NAD连接折叠和C-末端结构域。FaGAPDH1和FaGAPDH2蛋白与禾本科植物的该基因蛋白产物比较发现氨基酸序列的同源性都在90%以上,说明两基因具有高度的保守性。     

双磷酸核酮糖羧化酶和果糖双磷酸酯酶合成的光调节

用红光(650nm)或远红光(740nm)照射后,测定了黄化芥菜子叶中活化状态下核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(RuBPCase,E.C.4.1.1,39),果糖1,6-二磷酸酯酶(FBPase,E.C.3.1.3.11)和景天庚酮糖1,6-二磷酸酯酶(SBPase,E.C.3,1.3.37)的酶活性。叶片对光的反应表明存在光敏感期。在光敏感期的红光可使 RuBPCase 和 FBPase 合成,但对 SBPase 的合成没有影响。红光的这种作用可被远红光逆转,所以红光对这两种酶的合成的启动是通过光敏色素而实现的。在超过阈值的光下,酶合成的量与光量子数无关,光敏色素只影响酶合成的启动,但是酶的持续合成还要依赖其它因素。     

NADP~ 在兔肌甘油醛3-磷酸脱氢酶中作为氢受体的活力

兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶以NADP~ 作氢受体时,有极轻微的活力,实验表明它不是由于所用NADP~ 试剂中含有NAD~ 或酶制剂中含有磷酸酯酶、转氢酶等造成的干扰。采用高浓度酶对纯化后的NADP~ 测定结果是:NADP~ 作为氢受体的活力仅及NAD~ 的二百分之一。米氏常数K_m为700μm。NADP~ 对NAD~ 的还原无明显抑制作用。不同来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶对辅酶专一性程度有差别,酵母酶的专一性较兔肌酶为高:NADP~ 作为氢受体的活力仅为NAD~ 的千分之一。     

NADP~ 在兔肌甘油醛3-磷酸脱氢酶中作为氢受体的活力

兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶以NADP~ 作氢受体时,有极轻微的活力,实验表明它不是由于所用NADP~ 试剂中含有NAD~ 或酶制剂中含有磷酸酯酶、转氢酶等造成的干扰。采用高浓度酶对纯化后的NADP~ 测定结果是:NADP~ 作为氢受体的活力仅及NAD~ 的二百分之一。米氏常数K_m为700μm。NADP~ 对NAD~ 的还原无明显抑制作用。不同来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶对辅酶专一性程度有差别,酵母酶的专一性较兔肌酶为高:NADP~ 作为氢受体的活力仅为NAD~ 的千分之一。