一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果

为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒Ag株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKRN.采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间.经核酸及蛋白水平检测表明VTKRG△CKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性.重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱.VTKRG△CKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击.以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体.非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRG△CKRN免疫效果好、更具安全性.     

双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果

为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒aG株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRGΔCKRN。采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间。经核酸及蛋白水平检测表明VTKRGΔCKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性。重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱。VTKRGΔCKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击。以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体。非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRGΔCKRN免疫效果好、更具安全性。     

狂犬病毒G蛋白和N蛋白在痘苗病毒天坛株中共同表达

本文构建了一个能同时表达狂犬病毒糖蛋白（Ｇ）和核蛋白（Ｎ）两种蛋白的重组组痘苗病毒。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和免疫荧光等方法证明Ｇ和Ｎ基因已重组到痘苗病毒ＴＫ基因区,而且能良好地表达。并证明该重组病毒在小鼠中具有良好的免疫效果。     

我国单纯疱疹病毒Ⅰ型168株糖蛋白D基因的克隆及其在痘苗病毒天坛株中的表达

将我国单纯疮疹病毒Ⅰ型１６８株基因组ＤＮＡ中扩增出的糖蛋白Ｄ基因,插入痘苗病毒ｐ７．５启动子下游,使其在痘苗病毒天坛株表达。免疫荧光分析表明,产生的重组病毒糖蛋白Ｄ能被运到被重组病毒感染的１４３细胞表面表达,表达的产物经Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ鉴定为分子量约５０ｋＤ的多肽。Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ证明重组病毒基因组中整合有ＨＳＶ－１１６８株糖蛋白基因片段,重组病毒免疫家兔后,产生了高滴度的ＨＳＶ特异性中和抗体。     

我国单纯疱疹病毒I型168株糖蛋白D基因的克隆及其在痘苗病毒天坛…

将我国单纯疱疹病毒Ｉ型１６８株基因组ＤＮＡ中扩增出的糖蛋白Ｄ基因,插入痘苗病毒ｐ７．５启动子下游,使其在痘苗病毒天坛株表达,免疫荧光分析表明,产生的重组病毒糖蛋白Ｄ能被运到被重且病毒感染的１４３细胞表面表达,表达的产物经Ｗｅｓｔｅｎｂｌｏｔ鉴定为分子量约５０ｋＤ的多肽,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明重组病毒基因组中整合有ＨＳＶ－１１６８株糖蛋白基因片段,重组病毒免疫家兔后,产生了高滴度的ＨＳＶ特异性     

表达中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白的重组痘苗病毒的构建及免疫效果初步评价

目的:以痘苗病毒天坛株为载体,构建表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S蛋白的重组病毒疫苗,并进行免疫效果评价。方法:通过PCR扩增获得去除跨膜区的S蛋白基因片段SQ,并构建重组痘苗病毒载体质粒p JSC11Lac Z7.5SQ,将重组质粒与痘苗病毒同源重组并单斑纯化获得重组病毒毒株RVVMERS-SQ,重组病毒免疫小鼠后用酶联免疫吸附实验(ELISA)和假病毒微量中和实验检测其诱发的S蛋白体液免疫反应水平。结果:构建了表达MERS-Co V去跨膜区S蛋白的重组病毒RVVMERS-SQ,其免疫小鼠后诱发了强的S蛋白体液免疫反应,血清Ig G抗体滴度为1∶3200,中和抗体滴度达到1∶1000。结论:重组痘苗病毒RVVMERS-SQ可在BALB/c小鼠体内诱发强的免疫反应,为MERS-Co V疫苗的研发提供了实验基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨

以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK/gG-/LacZ 为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK/gG-/GP5 .经PCR、Southern杂交、Western blot证实构建正确,并能表达GP5.同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异.将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4.     

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法,对HPV581L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰,并保留氨基酸不变.选用非复制型重组痘苗病毒为载体,将修饰的L1基因1.5kb和L2基因1.4kb分别插入痘苗病毒表达载体pJSD的7.5k和H6早期启动子之后,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组.经单斑筛选纯化,获得共表达HPV58L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株.该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交分析,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV581L1及L2蛋白.此结果为HPV58型非复制型重组痘苗病毒疫苗人用株的研究打下了基础.     

麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)在痘苗病毒中的表达

将麻疹病毒F和HA基因插入到痘苗病毒中,分别处于痘苗启动子P7.5与P11控制下,获得重组病毒vLmF和vCmH。用抗F多肽抗体和HA单抗进行ELISA检测,结果表明,两株重组病毒均能表达相应的麻疹蛋白。蛋白印迹显示重组病毒表达产物在分子大小,蛋白切割和糖化方面与麻疹病毒糖蛋白一致。两株重组病毒分别免疫家兔都能产生较高滴度的麻疹抗体,这些抗体具有中和作用和血溶抑制作用。此外,vCmH产生的抗体还具有血凝抑制作用。     

杨尺蠖核型多角体病毒蛋白质的特性

本文研究了杨尺蠖核型多角体病毒(AciNPV)蛋白质特性,用反复调等电点法,从AciNPV的多角体蛋白中分离到A,B两种蛋白,Sepharose 6B柱层析和超离心沉降分析表明,两者均为一个峰纯,沉降系数(S20w)分别为4.9和8.9,对A蛋白进行了16种氨基酸组成分析,Glu、Asp和Leu含量高于其它氨基酸,不含Cys,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫双扩散法分析表明,用两倍体积饱和硫酸铵沉淀法制备的多角体蛋白,与提纯的多角体A、B蛋白之间无差异,多角体蛋白结构多肽由6种组成,分子量在12500—54000道尔顿范围内,其中32000是多角体蛋白的主要多肽,病毒粒子结构多肽和核衣壳蛋白分别由19和7个多肽组成,分子量范围分别在89000～13000和34000～13000之间,间接试验结果表明,在AciNPV中有碱性蛋白酶活性存在。     

禾谷类三种主要病毒病的电镜观察

在调查陕西、甘肃两省禾谷类三种病毒病：小麦线条花叶病毒病、小麦丛矮病毒病和玉米粗病毒病的发生危害基础上,采用超薄切片和电镜技术对发生在上述两省内的三种病毒进行了病毒粒子的直接观察。     

大菜粉蝶颗粒体病毒对菜粉蝶幼虫取食、生长、发育的影响

菜粉蝶幼虫在一、二、三、四龄初期饲以大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV),食量减少99.3—38.4%;四龄末或五龄初饲毒,食量反而比健虫高出36.3%和87.2%。幼虫感病后取食期的缩短或延长是食量变化的主要原因。幼虫病死前脱皮过程先被抑制,其结果往往使得死亡时所处的龄期明显延长。幼虫在四龄末饲毒后,由于五龄期延长,食量增加,其死亡前达到的最高体重平均为357.9毫克,远高于健虫化蛹前的最高体重。PbGV对菜粉蝶化蛹也有明显影响。幼虫在五龄前饲毒,一般不能化蛹。五龄第1—3天饲毒,化蛹率26.4—87.9%,第4天饲毒对化蛹无影响。本文结果对应用PbGv防治菜粉蝶幼虫危害以及对该病毒的大量增殖均具指导意义。     

ULTRASTRUCTURAL CHARACTERIZATION OF THE LYTIC CYCLE OF AN INTRANUCLEAR VIRUS INFECTING THE DIATOM CHAETOCEROS CF. WIGHAMII(BACILLARIOPHYCEAE) FROM CHESAPEAKE BAY,USA1

Numerous microalgal species are infected by viruses that have the potential to control phytoplankton dynamics by reducing host populations, preventing bloom formation, or causing the collapse of blooms. Here we describe a virus infecting the diatom Chaetoceros cf. wighamii Brightw. from the Chesapeake Bay. To characterize the morphology and lytic cycle of this virus, we conducted a time‐course experiment, sampling every 4 h over 72 h following viral inoculation. In vivo fluorescence began to decline 16 h after inoculation and was reduced to <19% of control cultures by the end of experiment. TEM confirmed infection within the first 8 h of inoculation, as indicated by the presence of virus‐like particles (VLP) in the nuclei. VLP were present in two different arrangements: rod‐like structures that appeared in cross‐section as paracrystalline arrays of hexagonal‐shaped profiles measuring 12 ± 2 nm in diameter and uniformly electron‐dense hexagonal‐shaped particles measuring ～ 22–28 nm in diameter. Nuclei containing paracrystalline arrays were most prevalent early in the infection cycle, while cells containing VLP increased and then declined toward the end of the cycle. The proportion of nuclei containing both paracrystalline arrays and VLP remained relatively constant. This pattern suggests that rod‐like paracrystalline arrays fragmented to produce icosahedral VLP. C. cf. wighamii nuclear inclusion virus (CwNIV) is characterized by a high burst size (averaged 26,400 viruses per infected cell) and fast generation time that could have ecological implications on C. cf. wighamii population control.     

马铃薯卷叶病毒的提纯

本文提出了一个应用液氮冷冻,一步提取,蔗糖垫层差速离心,Sephadex G-200柱层析以及蔗糖密度梯度离心法纯化马铃薯卷叶病毒的程序,改进后的马铃薯卷叶病毒提纯方法,使病毒产量达到1.18mg/kg酸浆组织,病毒提取物纯度比差速离心者更高,20％蔗糖垫层差速离心能够更加有效地去除宿主细胞成份,纯化病毒的OD260/280,260/240比值分别达到1.77和1.43。     

柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)转移载体质粒pAp M2614的组建

自从美国科学家G.Smith等首次建立苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)转移载体表达系统以来,已被广泛用于外源基因的表达,成为世界上一新的具有巨大潜力的载体表达系统。为了进一步提高表达产量,降低成本,日本科学家前田进建立了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体表达系统,并获得了高效表达。柞蚕是我国特产,以蛹滞育越冬,保存时间长,个体大,可工厂化生产。因此,组建柞蚕NPV转移载体,进而建立该载体表达系统,是目前利用昆虫活体为宿主进行外源基因表达较理想的昆虫杆状病毒载体表达系统。