通用型H5亚型禽流感病毒亚单位疫苗抗原表达和免疫效力研究

H5亚型高致病性禽流感病毒因其变异快、感染性和致病性强等特点严重威胁着家禽业和人类健康。为研制具有广谱保护性的H5亚型禽流感病毒通用型亚单位疫苗,本研究分析和对比各分支H5亚型禽流感病毒的HA蛋白基因,获得HA蛋白基因共有序列,采用杆状病毒表达系统构建和表达重组HA蛋白。经IFA、Western Blot、微量血凝试验等方法鉴定重组HA蛋白,结果显示重组HA蛋白在昆虫细胞中得到正确表达,血凝效价达13log2,且与禽流感Re6、Re7和Re8阳性血清均具有较好的交叉反应活性。免疫效力试验结果显示,重组HA蛋白疫苗组血清抗体能与H5亚型禽流感病毒Re6、Re7和Re8检测抗原反应,且能诱导机体产生较高水平IFN-γ和IL-4。该研究结果可为H5亚型禽流感通用型亚单位疫苗研发提供试验基础和科学依据。     

禽流感特异性转移因子的制备及其免疫作用

目的制备禽流感病毒特异性转移因子并探讨其对禽流感灭活疫苗的免疫增效作用。方法用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗免疫鸡,用国标血凝抑制方法检测病毒特异性血凝抑制抗体效价。当抗体效价达到高峰时,翅静脉采取外周血,分离淋巴细胞并制备细胞单层、传代后获得禽流感病毒H5N1血清亚型特异性转移因子。用所获得的特异性转移因子进行疫苗免疫增效试验。结果采用本法可获得禽流感病毒特异性转移因子。免疫增效试验表明,在进行禽流感病毒灭活疫苗免疫的同时使用禽流感病毒特异性转移因子,可在一定幅度内提高禽流感病毒抗体水平并能延长抗体维持时间。不同给药途径比较试验表明,口服途径给药的疫苗增效作用优于注射途径给药。结论通过淋巴细胞体外培养可以制备禽流感病毒特异性转移因子。禽流感病毒H5N1血清亚型特异性转移因子对禽流感病毒灭活疫苗具有明显的增效作用,且口服途径给药的疫苗免疫增效作用优于注射途径给药。     

利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段,近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因,分别构建了8个基因的转录与表达载体,利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)基因缺失与修饰,从而消除了病毒基因的毒力相关序列,拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性,病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高,分别为12048和1512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4~5周即可诱导产生高效价的HI抗体,鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96还是近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能够产生完全的免疫保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。     

人-禽双价流感新型DNA疫苗构建及免疫保护实验研究

流感病毒是威胁人类和动物健康的重要病原. 研究表明, 流感大流行株的形成与人流感和禽流感毒株基因重配密切相关. 因此在目前流感流行趋势下, 在人流感和禽流感疫苗开发中考虑对人流感和禽流感流行亚型进行共预防具有重要意义. 本研究针对人-禽多价流感疫苗进行了尝试, 构建了共表达H5亚型HA和H3亚型主要抗原区HA1的DNA疫苗pVAX1-H5/H3, 并进行了小鼠免疫攻毒研究. 结果表明, 攻毒前pVAX1-H5/H3有效诱导小鼠产生了针对 H5HA和H3HA1的体液抗体和细胞免疫应答. 当采用H5亚型和H3亚型流感病毒攻击时, pVAX1-H5/H3实验组小鼠对病毒攻击产生了抵抗作用, 显示了更快的体重回复及肺部病毒清除速度. 在H3亚型流感保护方面, pVAX1-H5/H3作用显著优于单表达H3HA1的pVAX1-H3. 结果证实, 共表达双亚型HA策略可对相关流感病毒攻击产生保护, 不同HA间未发现免疫干扰现象, 同时存在潜在的增益效果. 本研究为人-禽多价流感疫苗的研发奠定了基础.     

含禽流感病毒M2e 氨基端抗原表位的重组传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的免疫原性鉴定

【目的】构建传染性法氏囊病毒VP2蛋白展示禽流感M2e抗原表位的重组蛋白,研发预防H5或H9亚型禽流感和传染性法氏囊的基因工程疫苗。【方法】根据现有禽流感疫苗株M2e的氨基端12个氨基酸多肽序列(nM2e)序列,结合GenBank中H5和H9亚型禽流感病毒nM2e的比对结果,确定nM2e序列。用融合PCR分别将1拷贝H5或H9的nM2e序列插入IBD B87株VP2基因的PBC区,获得VP2BCnM2e重组基因。将重组基因克隆至杆状病毒表达系统,转染Sf9细胞进行表达。经间接免疫荧光和Western blotting检测Sf9细胞表达重组基因后,扩繁重组病毒,制备疫苗,间隔4周对非免鸡作2次重复免疫,用间接ELISA和鸡胚成纤维细胞中的病毒血清中和试验检测血清中VP2和nM2e的抗体效价。【结果】成功构建含H5或H9 nM2e的VP2BCnM2e重组基因,该重组基因在Sf9细胞中得到表达。经免疫鸡,两重组蛋白均能激发针对VP2和nM2e的抗体,VP2BCnM2eH5组抗体效价高于VP2BCnM2eH9组。【结论】两重组蛋白均具有免疫原性,VP2BCnM2eH5免疫原性更佳。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

禽流感血凝素基因的原核表达及其在H9亚型诊断中的应用

根据H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物 ,从本室分离并保存的H9N2亚型禽流感病毒中扩增了预计约 16 83bp的血凝素基因 ,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体 ,限制性酶切及序列测定后 ,进一步将其亚克隆到pGEX-KG中 ,与GST蛋白融合表达。SDS-PAGE和Western印迹表明缺失信号肽后的HA基因在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有免疫学活性 ,融合蛋白的分子量约为 90kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,利用复性产物作为抗原包被酶标板建立了检测H9亚型禽流感抗体ELISA方法。结果表明应用HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点 ,可用于H9亚型禽流感抗体的检测。     

抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究

多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质粒：1 pIRES/HA（表达全长的HA基因）;2 pIRES/tHA（只表达HA基因的主要抗原表位区）;3 pIRES/tHANpep（融合表达HA基因的抗原表位区和NP基因的3个CTL表位）;4 pIRES/tHANpep-IFN-γ（用鸡的IFN-γ基因取代质粒pIRES/tHANpep中的neo基因）。分别用这4个重组质粒和空载体质粒pIRES1neo肌注免疫30日龄SPF鸡。免疫3次,间隔为2周,每次每只鸡的剂量为200μg。第3次免疫后两周以高致病性禽流感病毒H5N1强毒攻击,免疫及攻毒前后均采血检测HI抗体效价和外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞的变化。结果发现,攻毒前各质粒免疫组均检测不到HI抗体,攻毒后1周存活鸡HI抗体效价迅速升高到64～256。流式细胞仪检测显示外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞在疫苗免疫后都有不同程度的升高。空载体质粒对照组鸡（10只）在攻毒后3～8 d内全部死亡,其他各重组质粒免疫组鸡都获得了部分保护,保护率分别是：pIRES/HA组为545%（6/11）,pIRES/tHA组为30%（3/10）,pIRES/tHANPep组为36.3%（4/11）, pIRES/tHANPepIFNγ组为50%（5/10）。这些结果表明我们构建的多表位DNA疫苗能够诱导机体产生特异性免疫应答,并在同型禽流感强毒攻击时对鸡只提供了一定的保护。     

含H5N1多个结构抗原的DNA疫苗与重组痘苗病毒疫苗联合免疫小鼠可明显增强免疫原性

本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案。利用本实验室前期构建的含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗及重组痘苗病毒(天坛株)疫苗,采用不同方案(单独或联合)免疫BALB/c小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体及M1与M2特异性抗体)和细胞免疫应答(IFN-γELIS-pot)的特点。结果表明:DNA疫苗与重组痘苗病毒(天坛株)疫苗联合免疫可以激发较强的多个抗原特异的免疫应答,尤其是体液免疫应答,明显优于DNA疫苗或重组痘苗病毒(天坛株)疫苗单独免疫;联合免疫方案中DNA疫苗初免所激发的HA与NA特异的体液免疫应答强于重组痘苗病毒(天坛株)疫苗初免,然而M1与M2特异的体液免疫应答则反之。本研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的实验免疫效果研究

将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门氏菌以1.0×1010CFU剂量口服接种1日龄SPF雏鸡,结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性。将重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,同时,将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫,通过测定小肠粘膜抗体效价,结果显示,重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答,且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(P<0.05)。攻毒后,免疫保护结果显示无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(P<0.05),而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异,说明重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)能够提供机体抵抗HPAIV H5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用,这为进一步筛选出基于粘膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础。     

实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究

选取H5、H9、H7亚型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）血凝素( hemagglutinin, HA) 基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计了各自亚型的特异性引物和Taqman MGB探针,利用实时荧光RT-PCR一步法建立了H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的鉴别检测方法,该方法特异性好,重复性佳,对其他疫苗无交叉反应。结果表明实时荧光PCR方法为禽流感灭活疫苗提供了一种特异、敏感、快速和简洁的鉴别检测方法。     

实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究

选取H5、H9、H7亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,利用PrimerExpress2.0软件设计了各自亚型的特异性引物和Taqman MGB探针,利用实时荧光RT-PCR一步法建立了H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的鉴别检测方法,该方法特异性好,重复性佳,对其他疫苗无交叉反应。结果表明实时荧光PCR方法为禽流感灭活疫苗提供了一种特异、敏感、快速和简洁的鉴别检测方法。     

稳定携带H5亚型禽流感病毒候选DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-HA扩增出禽流感病毒JSGO(H5N1)株的血凝素(HA)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1 中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-HA。通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207*,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)。经体内体外试验证实,重组质粒pmcDNA3.1-HA在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-HA。将重组菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)分别以2×109CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体。重组菌以5×109CFU剂量两次口服免疫试验鸡,免疫鸡的小肠样品中可测到针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体,且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的抗体效价高于SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组。免疫保护试验结果显示,SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05),且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的保护率较SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组提高了22.6%,说明稳定携带H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性。     

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA）,以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

A型禽流感病毒M2e重组T7噬菌体疫苗构建及免疫原性研究

构建展示A型禽流感病毒M2e多肽的重组T7噬菌体,检测其对SPF鸡的免疫保护效果。比对GenBank近期发表的A型禽流感病毒M2e基因序列进行人工合成并重复至两拷贝,将其克隆到T7Select 415-1b噬菌体多克隆位点,构建重组噬菌体T7-M2e。经PCR鉴定并序列测定筛选阳性重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernblot检测重组噬菌体表面M2e多肽。重组噬菌体以1×1010pfu/只剂量免疫SPF鸡,免疫后不同时间段采血通过ELSIA检测血清中抗M2e抗体,免疫荧光检测血清抗体与H9亚型禽流感病毒的结合能力,并以200个EID50/只剂量进行攻毒保护效率检测。成功构建重组噬菌体T7-M2e,插入两拷贝M2e基因获得表面展示,并与M2e抗体有免疫反应活性。噬菌体疫苗免疫后均产生抗M2e抗体,其抗血清能跟病毒粒子特异性结合,攻毒保护率达4/5(80%)。获得了展示禽流感病毒M2e多肽的重组噬菌体,噬菌体疫苗免疫鸡产生较高血清抗体并提供攻毒保护,为新型通用禽流感疫苗研制提供新思路。     

共表达禽流感病毒HA和NA基因重组禽痘病毒的遗传稳定性

将表达禽流感病毒H5HA及N1NA基因的重组禽痘病毒rFPV HA NA连续传代至 2 5代 ,取第 5、15及 2 5代重组病毒作为受检代次 ,进行外源基因的PCR扩增与测序 ,同时比较这 3个代次重组禽痘病毒的免疫效力。结果对各代次重组病毒DNA的模板进行PCR扩增 ,均能够获得HA和NA两个目的片段 ;经测序证明两个外源基因在细胞传代过程中没有发生氨基酸水平的改变。动物试验结果表明 ,该重组病毒的毒力在细胞传代过程中没有发生变化 ,接种试验鸡后在鸡体内能够检测到外源基因的存在 ,各免疫组在免疫 2周后的抗体效价平均为 6 5log2 ,完全抵抗了高致病力禽流感病毒的攻击。以上结果表明此重组病毒具有较好的遗传稳定性 ,经过 2 5代的传代后 ,所插入的外源基因及其表达产物的免疫原性未见变化 ,重组病毒的免疫效力相当稳定。     

禽流感新疫苗研制成功

能够彻底切断致命禽流感病毒向水禽、家禽及哺乳动物和人类传播的新型疫苗在我国研制成功。记近日从国家禽流感参考实验室了解到,针对H5N1亚型禽流感研制的两种新型疫苗已于近日通过科技部和农业部的联合验收,并获国家批准使用。此疫苗的研制成功填补了世界上水禽疫苗试验的空白。     

H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性研究

目的 评价H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性。方法 制备含MF59佐剂的H7N9禽流感病毒裂解疫苗成品,放置于(6±2)℃环境下,取保存6、24和30个月后的疫苗,对小鼠进行免疫,以血凝抑制效价和微量中和抗体滴度来评估该疫苗的免疫原性。同时,用存放30个月的疫苗进行2次免疫后,对小鼠进行攻毒,观察MF59佐剂疫苗的免疫保护效应。结果 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗在(6±2)℃保存30个月后免疫小鼠,检测其血凝抑制抗体效价和微量中和抗体滴度均没有明显的变化,且免疫小鼠能够有效抵御H7N9病毒的感染及其致病效应。结论 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗具有良好的免疫原性,在(6±2)℃至少可保存30个月。     

中国研制出新型人用H5N1禽流感活疫苗

中国国家禽流感参考实验室日前宣布研制出一种新型人用禽流感冷适应致弱活疫苗,有望对人类感染H5N1亚型禽流感病毒实现完全保护。与此前已有的人用禽流感灭活疫苗比较,新型活疫苗在免疫效果、生产工艺、使用方法等多     

表达H5亚型AIV血凝素的重组NDV构建及免疫原性

利用反向遗传技术获得表达H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的新城疫病毒(NDV)。克隆NDV clone 30的全长基因,通过在NDV的融合蛋白基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间插入编码高致病性AIV分离株A/chicken/italy/8/98(H5N2)的血凝素基因开放阅读框从而获得两株重组新城疫病毒NDVH5和NDVH5m。NDVH5感染的细胞可以检测到两种HA转录产物。对于重组病毒NDVH5m,NDV位于HA ORF的转录终止信号序列被沉默突变消除,产生2.7个全长HA转录产物的折叠,从而使修饰过的HA得到稳定地高表达。1日龄小鸡的脑内接种证实了两种重组病毒均无致病性。鸡群在NDVH5m诱导产生的NDV和H5亚型AIV HA特异性抗体的免疫力下能够免于致死剂量的NDV与高致病性AIV的感染。血清学研究结果表明NDVH5m免疫鸡群产生的抗体可结合NP蛋白抗体的检测从而用于区分免疫和感染AIV的动物。因此,NDVH5m重组病毒可作为抗NDV和AIV的"二联疫苗",也可成为控制AJ的标记疫苗。