酵母酸性磷酸酶基因表达的分子机制

酵母酸性磷酸酶基因表达的分子机制敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,上海２０００３１）酵母酸性磷酸酶ＰＨＯ５基因是一种阻遏型基因,它的表达受高浓度无机磷的阻遏,在低浓度无机磷条件下去阻遏［１］。ＰＨＯ５基因的转录至少受５种蛋...     

酵母酸性磷酸酯酶转录调控因子PHO2的功能域分析

利用定点诱变,氨基酸插入或缺失的方法对ＰＨＯ２进行结构改造,观察对其功能的影响。ＰＨＯ２蛋白的同源域中有α－螺旋２－β－转我－α螺旋３的结构,是转录因子结构ＤＮＡ的功能域。定点诱变α－螺旋３上的Ｉｌｅ１２３为Ｐｒｏ１２３或者在α－螺旋２中插入ＰＤＰＤ４个氨基酸,破坏α－螺旋的结构,可导致ＰＨＯ２功能的丧失。氨基酸片段的缺失分析表明,Ｎ端Ｇｉｎ丰富区大部缺失,对ＰＨＯ２功能没有影响;而包含酸性氨基酸     

酵母PHO81在酸性磷酸酯酶基因表达调控中的作用

利用酵母ＰＨＯ８１与大肠杆菌β－半乳糖苷酶的融合基因,系统地研究了ＰＨＯ８１基因在酵母酸性磷酸酯酶的不同调控因子的单缺失株和双缺失株中的表达规律,它与酸性磷酸酯酶基因ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１的控制机制相似。构建 了ＡＤＨ１启动子控制下ＰＨＯ８１表达质粒。在ＰＨＯ８１在细胞内组成型表达时,酸性磷酸酯酶基因的表达仍受无机磷的控制,提示ＰＨＯ８１蛋白可能在不同浓度无机磷条件发生变构。ＰＨＯ８１的酸性磷酸酯酶     

酵母PH081在酸性磷酸酯酶基因表达调控中的作用

利用酵母ＰＨＯ８１与大肠杆菌产β－半乳糖苷酶的融合基因,系统地研究了ＰＨＯ８１基因在酵母酸性磷酸醋酶的不同调控因子的单缺失株和双缺失株中的表达规律,它与酸性磷酸酯酶基因ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１的控制机制相似。构建了ＡＤＨ１启动子控制下ＰＨＯ８１表达质粒。在ＰＨＯ８１在细胞内组成型表达时,酸性磷酸酯酶基因的表达仍受无机磷的控制,揭示ＰＨＯ８１蛋白可能在不同浓度无机磷条件发生变构。ＰＨＯ８１在酸性磷酸酯酶基因表达系统中是一个中介因子。在此基础提出了一个酸性磷酸酯酶基因调控的分子模型。     

CENP——B的基因表达与细胞周期关系的研究

本文以Ｈｅｌａ细胞为材料研究一种有丝粒蛋白ＣＥＮＰ－Ｂ的基因表达与细胞周期及细胞核骨架的关系。将Ｈｅｌａ细胞同频不同周期时相,以流式细胞光度术、同位素掺入和ＡＣＡ着丝粒染色等方法检测细胞同步化效果。我们分别提取了各周期时相细胞的总ＲＮＡ和Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ,用Ｄｏｔ ｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交方法研究ＣＥＮＰ－Ｂ在细胞周期中的表达。结果表明,ＣＥＮＰ－Ｂ基因在细胞周期中的各个时     

酵母PHO80基因的克隆,表达及功能分析

利用原位杂交方法从野生型酵母菌染色体ＤＮＡ中克隆了ＰＨＯ８０基因,全长约４．２ｋｂ,包括１．１ｋｂ的上游序列和８７９ｂｐ的编码序列。以ＵＲＡ３基因为筛选标记,通过体内同源重组和营养互补筛选获得了ＰＨＯ８０基因缺失突变株。进一步研究了ＰＨＯ８０在细胞内的功能,它是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶结构基因以及调控基因ＰＨＯ８１表达的负调控因子,但不影响ＰＨＯ４和ＰＨＯ８５的表达。还构建了ＰＨＯ８０－ＬａｃＺ融合基因,探索它在细胞内的表达规律。β－半乳糖苷酶活力测定结果表明,ＰＨＯ８０基因在细胞内呈低水平表达,并受自身产物和ＰＨＯ８５的抑制,推测它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ８１基因的调控模式可能相似。     

酵母PHO85基因的定点诱变和功能分析

克隆酵母ＰＨＯ８５基因，用ＵＲＡ３基因取代其部分编码序列，通过染色体同源重组的途径，构建ＰＨＯ８５缺失突变株。以细胞内酸性磷酸酯酶的活力水平显示ＰＨＯ８５的功能作用。完整ＰＨＯ８５基因转入缺陷型酵母菌，能使表达回复，位点专一诱变的ＰＨＯ８５基因（Ｇｌｙ１３→ＡＳＰ或ＬＹＳ３３→Ｇｌｕ）丧失此种功能。ＰＨＯ８５与ＣＤＣ２８编码的蛋白激酶有较高的同源性。ＰＨＯ８５的Ｇｌｙ１３和Ｌｙｓ３３相当于蛋白激酶     

酵母PHO4基因的克隆与表达

用原位杂交方法从酵母菌染色体ＤＮＡ中分段克隆,拼接,获得完整的ＰＨＯ４基因,全长约３．４ｋｂ,利用体内同源重组的方法,构建了ＰＨＯ４基因缺失突变株。ＰＨＯ４基因的缺失导致酸性磷酸酯酶活性明显下降,将完整的ＰＨＯ４基因转入这种缺陷细胞,能使酶活性回复到野生型水平,ＰＨＯ４起正调控作用,构建ＰＨＯ４－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ４的表达水平。融合基因不同名的表达表明,ＰＨＯ４基因     

大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶研究Ⅲ、非专一性酸性磷酸酯酶的纯化与特性

从大豆叶片中分离能水解磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酸性磷酸酯酶,通过硫酸胺分部(20%～50%饱和度)沉淀、DEAE纤维素层析、刀豆球蛋白琼脂糖凝胶亲和层析将酶纯化了422.47倍,活性达78.16U/mg蛋白。该酶对PEP专一性不强,Km为1.09mmol/L(PEP),最适pH5.8,在pH4.8～7.0范围内及60℃以下较稳定,水解PEP的活性被Mg2+、Mn2+激活,F、Cu2+、Zn2+、PO43、MoO42及3磷酸甘油酸(3PGA)、三磷酸腺苷ATP等代谢物抑制,受异柠檬酸等有机酸影响较小。     

酵母细胞周期调控的研究进展

酵母是一种研究细胞周期调控的好材料,在细胞周期的调控研究中具有重要作用。现在通常以芽殖酵母和裂殖酵母为代表进行研究。这两种酵母的细胞周期进程与高等真核生物相比各有其特点。 酵母细胞周期运行中存在有三个不同的控制点,即start点、S期启动点、G2/M转换处。在这三个不同的控制点起作用的CDK的组成是不同的。芽殖酵母分别是Cdc28-Clns;Cdc28-Clb5和Cdc28-Clb6;Cdc28-Clb1、Cdc28-Clb2、Cdc28-Clb3和Cdc28-Clb4。裂殖酵母中分别是Cdc2-Cig2;Cdc2-Cig2;Cdc2-Cdc13和Cdc2-Cig1,其中芽殖酵母中的Cdc28和裂殖酵母中的cdc2是等效基因。不同的控制点存在着不同 的调控机制,它们涉及到大量的基因,其中以G2/M转换处的调控机制研究得最早也最透彻。另外,APC途径在M中期/后期转化中起着重要作用。     

斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶学性质研究

以斑玉蕈为材料分别从菌盖和菌柄中提取一种酸性磷酸酯酶（ACPase,EC.3.1.3.2）,进一步用硫酸铵沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,从菌盖中分离到3个酶组分,从菌柄中分离到4个酶组分,分别对菌盖和菌柄的酶Ⅰ和酶Ⅰ′进行聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳纯度鉴定,均呈现单一酶蛋白带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定酶Ⅰ和酶Ⅰ′的相对分子量均为65kDa,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Sephadex G-75凝胶过滤测定分析,酶Ⅰ和酶Ⅰ′均为单亚基蛋白。紫外吸收光谱（UV）测     

萌发木豆种子中酸性磷酸酯酶的纯化和动力学特性

以对硝基苯磷酸为底物检测酶活性,通过20%～60%硫酸铵分部、DEAE-葡聚糖A25、羟基磷灰石、伴刀豆球蛋白-琼脂糖4B柱层析,从木豆萌发的种子中纯化到一个同工酶APaseⅡ,酶最终纯化倍数为247倍,比活力达51.8U/mg蛋白。非变性PAGE和SDS-PAGE表明所纯化的酶已经达到电泳纯,是一个分子量为33.1kDa的单体蛋白。APII的最适pH为5.0,最适温度为35℃,在pH3.5～7以及55℃以下稳定。该酶对焦磷酸有最大活性,受K+和Mg2+激活,受Fe2+,Mn2+,Mo7O246-,F-及酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、草酸、柠檬酸、乙醇酸、乙醛酸和抗坏血酸等有机酸抑制。     

甲基营养型酵母基因表达系统

甲基营养型酵母为第二代酵母表达系统,具有表达水平高,产物活性好,培养成本低,易扩大为工业化生产等特点,近来得到越来越广泛的应用。本文就该系统的载体构件、外源基因与宿主染色体的整合、分泌表达、影响表达量因素等方面作一综述     

一种值得注意的基因表达系统——巴斯德毕赤氏酵母

正当我们热衷于利用大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)等传统表达系统来研究各种基因表达时,国外一些新型表达系统正在悄然兴起。这些系统有着独特的优点,潜力很大,可能对今后基因工程产品的开发和生物技术的发展产生重要作用。其中巴斯德毕赤氏酵母(Pichia Pastoris)特别值得引起我们的注意。本文对该系统作一简要评述。     

人胎盘碱性磷酸酯酶基因在毕赤酵母中的表达和活性检测

将人胎盘碱性磷酸酯酶 (hPLAP)基因克隆到质粒ppICZαA中并在巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris蛋白酶缺陷菌株SMD1 1 6 8中诱导表达。结果表明 :2拷贝子的重组酵母诱导表达产物酶活性最高 ,拷贝Mut 和Muts 表型不同对hPLAP酶活性没有显著影响     

毕赤酵母外源基因表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质。与酿酒酵母Saccharomyces ceresiviae相比,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛。有关研究主要涉及以下几个方面：宿主菌株,表达载体,转化方法,外源基因整合,外源蛋白糖基化和高密度发酵培养等。     

甲醇酵母基因表达系统的研究进展

在大肠杆菌这一传统表达系统被频繁用作研究各种基因表达时,一种新型且有效的基因表达系统－甲醇酵母正逐渐引起人们的注意。本文对甲醇酵母基因表达系统的特点及研究进展作一简要综述。