大肠杆菌质粒DNA PCR模板的快速制备

在分子遗传学的研究中要频繁地用到ＰＣＲ的方法。本文基于粗糙脉孢霉的方法[1] 发展了快速制备大肠杆菌质粒ＤＮＡＰＣＲ模板的程序 ,具有良好的重复性 ,为分子遗传学研究提供了快速有效的方法。收稿日期 :2 0 0 1 - 1 0 - 2 0 ;修回日期 :2 0 0 1 - 1 1 - 2 1基金项目 :广东省自然科学基金 (Ｎｏ.980 30 3) ;国家自然科学基金 (Ｎｏ .30 0 70 4 2 0 ) ;教育部高等学校骨干教师计划资助项目 (Ｎｏ.2 0 0 0 - 0 61 -31 4 30 1 )作者简介 :罗樨 (1 977- ) ,女 ,硕士 ,从事生物钟研究。图 1　质粒ＤＮＡＰＣＲ扩增结果1 ＤＬ2 0 0 0分子量标…     

激光作用质粒DNA和小牛胸腺DNA的AFM研究

激光作用质粒ＤＮＡ和小牛胸腺ＤＮＡ产生损伤效应,导致ＤＮＡ结构变化,利用一种改进的试样制备过程和纳米显微镜--原子力显微镜（ＡＦＭ）能够获得可重现的激光作用质粒ＤＮＡ和小牛胸腺ＤＮＡ的ＡＦＭ图象,显示它们的特殊的表面结构。     

利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

制备基因组ＤＮＡＰＣＲ模板一般都比较费工费时 ,研究人员尝试用微波炉提取真核生物基因组ＤＮＡ ,然后做ＰＣＲ扩增取得了较好的效果[1 ,2 ] 。本文描述了一个利用微波炉快速制备酵母质粒和基因组ＤＮＡＰＣＲ模板的程序 ,具有良好的重复性。1　材料与方法1.1　材料酿酒酵母菌种 1ｃ163 6ｄａｒｇ11,ｕｒａ 3为比利时ＯｒｉａｎｅＳｏｅｔｅｎｓ馈赠。酵母载体ｐＹＸ13 3从美国康乃尔大学曹维国处获得 ,并由此构建了粗糙脉孢霉ａｒｇ 13ｃＤＮＡ的酵母表达载体ｐＹＸＡ5。培养基为ＳＤ或ＹＰＤ固体培养基。1.2　酵母质粒提取[3]取 1.5ｍｌ…     

快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

发展了一个利用煮沸法快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板的程序,成功地从低拷贝的ARSCEN酵母质粒和酵母基因组扩增到了相应基因。     

临床等级质粒DNA的实验室制备

在实验室有效获得100 mg临床试验等级的质粒DNA.摇床发酵3个批次,每批次4 L培养液,产生大约160 g的细菌沉淀物.碱裂解菌体,气浮法结合离心分离浮杂沉淀.裂解液经0.45/0.22 μm囊式过滤器过滤.然后采用阴离子色谱介质富集质粒,异丙醇沉淀.重新溶解沉淀后采用100 kD切向流超滤处理,获得100 mg临床试验等级质粒DNA.体外、体内转染试验对质粒表达效果进行了鉴定.结果表明,纯化的质粒DNA几乎检测不到内毒素、RNA和蛋白质,A260/A280比值在1.82～1.86范围内.纯化的质粒DNA能够满足动物临床试验.     

体积排阻液相色谱法质粒的含量测定

首次以体积排阻液相色谱法进行质粒提取液浓度的测定研究,通过纯质粒溶液在260 nm处的紫外吸峰面积与质粒浓度之间数据的线性最小二乘拟合,得到了反映质粒浓度和紫外吸收峰峰面积之间关系的标准曲线:Y=2×10~(-5) X,通过验证实验,确定了质粒提取液中不同组分,如核糖核酸,蛋白质等在色谱图中的出峰位置.结合标准曲线测定了自制的质粒提取液的质粒浓度为0.32 mg/mL.该方法方便,快捷,准确.     

碱裂解提取质粒DNA的改进

碱裂解提取质粒DNA是分子生物学实验中常用的方法,但通常方法所提取的质粒往往含有大量的RNA和其他杂质.本文适时加入较高浓度的RNA酶和适当延长冰浴时间,结果得到了几乎没有RNA和其他杂质的高纯质粒DNA,不仅达到了分子生物学实验要求,而且可用作抗原检测抗dsDNA抗体.该法操作简单、经济、实用.     

Tris对高LET碳重离子辐照下质粒DNA链断裂的保护作用

利用100 keV/μm碳离子束(初始能量为290 MeV/u)照射溶解于纯水、10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA及TE 缓冲液中的pUC19质粒DNA.通过琼脂糖凝胶电泳技术分析了不同溶液中各种形态DNA分子所占份额,并计算得到不同剂量下平均每个质粒分子中单链断裂(SSB)及双链断裂(DSB)的数目.发现Tris通过抑制SSB和DSB的产生对碳重离子辐照下的质粒DNA有明显的保护作用,而EDTA能够加剧SSB的产生而抑制DSB的形成.     

中药对R质粒消除作用的研究

由于 R质粒的传播和耐药菌株的增加 ,临床抗菌药物的敏感性下降 ,为临床治疗带来极大的困难。人们试图寻找出一种有效的方法把 R质粒从宿主菌中消除掉 ,使其重新恢复对药物的敏感性。许多理化因素均可消除质粒 ,如高温培养、紫外线照射 ,常用的化学消除剂有 SDS、溴化乙啶与口丫啶橙等。但由于这些因素对人体均有较强的毒副作用 ,不能投入临床应用。目前耐药 R质粒的消除仍是一个国际性难题 ,到现在为止还没有一个较好的可供体内使用的消除 R质粒的方法。而中草药具有天然、低毒甚至无毒的特点 ,人们希望从我国传统中药中选择出非常适合…     

一种蓝藻质粒DNA的快速检测法

蓝藻(blue-green algae)也称蓝细菌(cyanobacteria),具高等植物型放氧光合作用.蓝藻在原初生产力和固氮方面的重要性已得到充分证明,一些蓝藻的固氮作用与光合放氧过程同在一个细胞中进行.有些蓝藻富含蛋白质,可作为天然的蛋白质来源.蓝藻在环境保护中也有重要意义.正因为如此,近年来蓝藻基因工程蓬勃兴起.       

二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质、DNA含量的影响

分析了二氧化氯(1.0、1.5、2.0、2.5mgL-1,作用96h;2.5、6.0、8.0、16.0mgL-1,作用60min)对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质含量、氨基酸组成、核酸含量的影响,用透视电镜对二氧化氯(0.5mgL-1,0.8mgL-1)作用24h后藻细胞形态的变化进行了观察,以探讨二氧化氯去除赤潮藻的机理。结果表明,二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质、DNA的含量均有影响。实验各组(1.0-2.5mgL-1,2.5-16.0mgL-1)球形棕囊藻的叶绿素a、蛋白质、DNA的含量均显著低于对照。二氧化氯浓度超过2mgL-1时,球形棕囊藻的叶绿素a、蛋白质、DNA的含量持续降低,氨基酸相对含量发生明显变化;半胱氨酸、酪氨酸和赖氨酸等的相对含量明显降低,而组氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸则明显增加。当二氧化氯(2.5-16.0mgL-1)作用3min后,DNA漏出率在13%-18%之间;电镜观察发现,二氧化氯可使细胞膜破损,引起内容物外泄。这些结果显示,二氧化氯能以单分子形式进入细胞,引起叶绿素、蛋白质结构的变化,并破坏藻细胞膜系统,最终导致藻细胞死亡。     

二氧化氯溶液消毒剂对呼吸道病毒的杀灭效果评估

目的:评估"菌bye-bye"消毒剂对甲型H1N1流感病毒PR8(PR8)、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型腺病毒(ADV3)、人感染H7N9禽流感病毒(H7N9)的体外杀灭效果。方法:参考《消毒技术规范》和受试产品说明书进行细胞毒性试验、消毒剂中和试验和对PR8、RSV、ADV3、H7N9病毒的体外杀灭实验。结果:(1)候选中和剂选定0.02mol/L硫代硫酸钠(Na_2S_2O_4);(2)候选中和剂、"菌-bye-bye"消毒剂及两者混合物对细胞毒性低;(3)候选中和剂能完全中和消毒剂消毒效果;(4)随着"菌bye-bye"消毒剂的浓度增大,病毒杀灭效果亦越好。在其不稀释的条件下,除了PR8毒株外,其他3种病毒的平均灭活率均在99.99%以上,且平均病毒TCID50负对数值(log_(10)TCID_(50)/m L)均降低4 log_(10)或以上;对半稀释后对RSV的杀灭效果最好,而对ADV3的杀灭效果最差。结论:高浓度"菌bye-bye"消毒剂对呼吸道病毒的杀灭效果较好,且对细胞的毒性较小,是一种安全、高效的消毒剂,值得临床推广。     

Plasmid transformation of Bacillus cereus on cellophane membranes

A simple approach to test the ability of bacteria to undergo natural genetic transformation is suggested. The basic feature of the approach is the cultivation of bacterial cells in the presence of exogenous (plasmid) DNA on cellophane membranes placed successively on nutrient and selective agar. Using this approach the ability of Bacillus cereus for "natural" genetic transformation was detected. Transformation frequencies varied from 10(-8) to 10(-6).     

Plasmid transformation of Ruminococcus albus by means of high-voltage electroporation

To apply recombinant DNA techniques to the genetic manipulation of cellulolytic ruminal bacteria, a plasmid vector transformation system must be available. The objective of this work was to develop a system for plasmid transformation of Ruminococcus albus. Using high voltage electrotransformation, pSC22 and pCK17 plasmid vectors, derived from lactic acid bacteria plasmids and replicating via single-stranded DNA intermediate, were successfully introduced into three freshly isolated R. albus strains and into R. albus type strain ATCC 27210. The optimization of the electrotransformation condition raised the electroporation efficiency up to 3 x 10(5) transformants per microgram of pSC22 plasmid.     

转化条件对质粒DNA转化大肠杆菌的影响

研究了质粒DNA大小、质粒DNA浓度、CaCl2 浓度、热休克时间及感受态细胞保藏时间等因素对大肠杆菌HB1 0 1和JM1 0 5转化频率的影响 ,并对转化子中质粒DNA进行了分离、酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明 ,CaCl2 浓度、质粒大小和浓度 ,以及感受态细胞的活力对转化频率有重要影响 ,42℃热休克处理可以提高转化频率。     

Plasmid transformation of Clostridium perfringens by electroporation methods

Two electroporation methods were compared and modified to improve the frequencies of transfer of plasmid DNA into Clostridium perfringens. A plasmid shuttle vector, pSB92A2, containing chloramphenicol and ampicillin resistance genes and a clostridial origin of replication isolated from a cryptic C. perfringens plasmid, was constructed and successfully introduced into C. perfringens by both electrotransformation methods. Modifications which improved frequencies by 15-28 fold are described and may improve frequencies sufficiently for some vector/host combinations to consider the future use of more direct cloning strategies for the clostridia.     

Mechanisms of Allosteric Activation and Inhibition of the Deoxyribonucleoside Triphosphate Triphosphohydrolase from Enterococcus faecalis

EF1143 from Enterococcus faecalis, a life-threatening pathogen that is resistant to common antibiotics, is a homo-tetrameric deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) triphosphohydrolase (dNTPase), converting dNTPs into the deoxyribonucleosides and triphosphate. The dNTPase activity of EF1143 is regulated by canonical dNTPs, which simultaneously act as substrates and activity modulators. Previous crystal structures of apo-EF1143 and the protein bound to both dGTP and dATP suggested allosteric regulation of its enzymatic activity by dGTP binding at four identical allosteric sites. However, whether and how other canonical dNTPs regulate the enzyme activity was not defined. Here, we present the crystal structure of EF1143 in complex with dGTP and dTTP. The new structure reveals that the tetrameric EF1143 contains four additional secondary allosteric sites adjacent to the previously identified dGTP-binding primary regulatory sites. Structural and enzyme kinetic studies indicate that dGTP binding to the first allosteric site, with nanomolar affinity, is a prerequisite for substrate docking and hydrolysis. Then, the presence of a particular dNTP in the second site either enhances or inhibits the dNTPase activity of EF1143. Our results provide the first mechanistic insight into dNTP-mediated regulation of dNTPase activity.     

气道内微量雾化机对质粒DNA完整性和基因转染效率的影响

目的:探索新型气道内微量雾化机对质粒DNA(pDNA)完整性和整体动物基因转染效率的影响。方法:首先,研究新型气道内微量雾化机对pDNA破坏程度。分别向新型气道内微量雾化机和目前临床普遍使用的机械喷射式雾化机的加药池内加入2ml pDNA(20μg/ml),在开始雾化后第1min、3min、5min分别收集两种雾化机嘴处的雾化液滴,用琼脂糖凝胶电泳观察比较质粒的完整性。其次,研究整新型气道内微量雾化机在整体动物上对基因转染效率的影响。分别用新型气道内微量雾化机和目前临床普遍使用的机械喷射式雾化机,给大鼠雾化经多聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)修饰的相同量的绿色荧光蛋白质粒(plasmid DNA of green fluorescent protein gene, pEGFP)3.3μg(PEI/pEGFP),24h后提取动物肺组织进行反转录,用real time PCR及琼脂糖凝胶电泳观察分析绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的mRNA表达情况。结果:新型气道内微量雾化机在雾化第1min、第3min、第5min后完整的质粒比例分别为(99.6±0.7)%、(100±1.2)%、(99.6±0.7)%,与未雾化对照相比(P>0.05,n=3),无统计学差异,新型雾化机对质粒破坏性可以忽略。临床常用的喷射式雾化机在相同时间段内完整的质粒比例分别为(70.3±1.5)%、(49.3±1.5)%、(32.7±0.6)%。与未雾化对照相比(P<0.05,n=3)有统计学差异,并且随雾化时间增加临床常用的喷射式雾化机对质粒的完整性破坏程度逐渐增加;新型气道内微量雾化机的基因转染效率高于临床普遍使用的机械喷射式雾化机转染效率的(382.1±101.1)倍(P<0.01,n=3)。结论:新型气道内微量雾化机对质粒没有破坏性,能显著增加雾化吸入基因转染效率。为雾化基因治疗提供了一种合适的工具。     

鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒对生物膜形成的影响

目的:鼠伤寒沙门菌在多种表面形成的生物膜对其致病性和引起食物中毒等方面起着重要作用,本研究探讨鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒对细菌在不同材质表面生物膜形成的影响。方法:用LB(Luria-Bertani,LB)培养基和TSB(Tryptose Soya Broth,TSB)培养基分别将携带pStSR100质粒的野生株在96孔板与放置无菌小圆玻片的24孔板中静态培养48 h,用结晶紫半定量法确定生物膜形成的适宜培养基。将野生株与消除质粒的突变株,用结晶紫半定量法和激光共聚焦显微镜(Confocal Laser scanning microscopy,CLSM)观察其在聚苯乙烯培养板和小圆玻片表面形成生物膜的差异。结果:用LB培养时细菌生物膜的形成能力高于用TSB培养,LB培养基更适宜生物膜形成;结晶紫半定量法结果表明野生株比突变株在小圆玻片表面形成生物膜的能力明显增强,而在聚苯乙烯培养板表面两者则无明显差异;CLSM观察发现,野生株在小圆玻片表面形成融合成片的大克隆,突变株仅形成较小克隆。结论:鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒能促进该菌在亲水性材质表面生物膜的形成,但其对该菌在疏水性材质表面生物膜的形成未见明显影响,这一新发现为进一步研究鼠伤寒沙门菌生物膜形成的调控机制,研制抗感染材料提供了理论和实验依据。