甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达.提取流感病毒Influenza A/FM/1/47 (H1N1) RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到Vero细胞,免疫荧光技术鉴定其表达.甲型流感病毒M1蛋白重组质粒pcDNA3.1-M1的成功构建,为开发研制流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定了基础.     

线虫Fat-1基因密码子的优化及其真核表达载体构建

目的:为使线虫Fat-1基因能够在牛中高效表达,通过密码子优化及全基因合成方法制备Fat-1基因,并构建其转基因表达载体。方法:通过生物信息学手段,将来源于线虫的Fat-1基因以牛为表达宿主进行密码子优化,将优化后的Fat-1基因命名为bFat-1;通过全基因合成方法获得bFat-1基因,构建pcDNA3.1-bFat-1真核表达载体。结果:通过密码子优化,影响Fat-1基因在牛中表达的密码子适应指数、优势密码子频率及GC含量等各项指标均有显著改善;全基因合成、克隆及测序结果显示已获得bFat-1基因;构建并鉴定了pcDNA3.1-bFat-1载体。结论:获得了适合牛体表达的Fat-1基因并构建了其转基因载体,为获得高效表达Fat-1基因的转基因牛细胞系奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

IFITM1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:获得IFITM1基因片段并构建真核表达质粒.方法:采用RT-PCR技术扩增IFITM1,将扩增产物连接至pcDNA3.1载体,对重组质粒进行测序验证,结果:构建了真核表达质粒pcDNA3.1-IFITM1,通过酶切、测序等方法验证完全正确.结论:成功构建了IFITM1基因的真核表达质粒,为下一步探讨IFITM1基因在子宫颈癌HeLa细胞中的作用提供了实验基础.     

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-1 gag基因,并与真核表达载体pCI-neo连接,构建含有中国流行株HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.经XbaⅠ/SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.通过脂质体将pCI-neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物.结果表明所构建的HIV-1 核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础.     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunode- ficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的世界广泛流行、严重危害人类健康的疾病.     

Cpn0308基因真核载体构建及鉴定

目的:构建Cpn0308基因真核表达重组质粒,为肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cpn)核酸疫苗的研制做准备。方法:用PCR技术从Cpn AR39株基因组DNA中扩增Cpn 0308基因,经双酶切、连接等反应,重组入pcDNA3.1/HisA真核表达载体,转化到感受态细胞,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选,酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果:从Cpn AR39株基因组DNA中扩增出特异的Cpn 0308基因,约400bp;酶切、重组、转化、筛选鉴定出pcDNA3.1/HisA-Cpn0308重组质粒;序列测定证实与GenBank登录的肺炎衣原体Cpn AR39株Cpn0308基因一致。结论:功地构建了pcDNA3.1/HisA-Cpn0308重组质粒,为肺炎衣原体核酸疫苗的研制奠定了基础。     

人H-ras基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的促进作用

目的:构建癌基因H-ras真核表达载体,并检测其对肿瘤细胞生长的作用。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增H-ras基因片段,将其插入p XJ-40-myc载体后转染人胚肾HEK293T细胞,用Western印迹检测该融合蛋白的表达;将重组质粒转染人肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞,通过细胞生长曲线(CCK8法)对myc-H-ras影响肿瘤细胞生长的情况进行分析。结果:利用PCR技术,从乳腺文库中扩增出H-ras基因片段,并成功插入p XJ-40-myc载体;重组质粒转染HEK293T细胞,经Western印迹检测融合蛋白正确表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-H-ras的结肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞比转染空载体的细胞生长快。结论:构建了人H-ras基因真核表达载体,为进一步研究ras基因在肿瘤细胞中的作用奠定了一定基础。     

Fat-1基因真核表达载体的构建及其对人口腔鳞癌细胞脂肪酸含量的影响

目的：构建真核表达载体pcDNA3．1-Fat1,线性化稳定转染人口腔鳞癌细胞株Tca8113,检测其细胞内脂肪酸含量变化。方法：通过重叠延伸PCR方法人工合成利于真核表达的Fat-1基因,用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA3．1-Fat—1,用脂质体转染真核细胞的方法转染人1：／腔鳞癌细胞株Tca8113,用气相色谱仪检测脂肪酸的变化情况。结果：测序及酶切鉴定成功合成真核偏好表达的Fat-1基因。与对照组相比,转染Fat—1基N的口腔癌细胞的n-3脂肪酸明显增多,n-6／n-3明显下降。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3．1-Fat1,并对口腔鳞癌细胞内脂肪酸含量产生明显影响,为进一步研究Fat-1基因在口腔鳞癌中的生物学功能奠定了基础。     

Fat-1 基因真核表达载体的构建及其对人口腔鳞癌细胞 脂肪酸含量的影响

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1-Fat1,线性化稳定转染人口腔鳞癌细胞株Tca8113,检测其细胞内脂肪酸含量变化。方法:通过重叠延伸PCR方法人工合成利于真核表达的Fat-1基因,用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1-Fat-1,用脂质体转染真核细胞的方法转染人口腔鳞癌细胞株Tca8113,用气相色谱仪检测脂肪酸的变化情况。结果:测序及酶切鉴定成功合成真核偏好表达的Fat-1基因。与对照组相比,转染Fat-1基因的口腔癌细胞的n-3脂肪酸明显增多,n-6/n-3明显下降。结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-Fat1,并对口腔鳞癌细胞内脂肪酸含量产生明显影响,为进一步研究Fat-1基因在口腔鳞癌中的生物学功能奠定了基础。     

An inducible constitutive expression system in Bombyx mori mediated by phiC31 integrase

Inducible gene-expression systems play important roles in gene functional assays in the post-genome era. Streptomyces phage-derived phiC31 integrase, which mediates an irreversible site-specific cassette exchange between the phage attachment site (attP) and the bacterial attachment site (attB), provides a promising option for the construction of a controllable gene-expression system. Here, we report a phiC31 integrase-mediated promoter flip system (FLIP) for the inducible expression of target genes in silkworm (Bombyx mori). First, we constructed a FLIP reporter system, in which a BmAct4 promoter with enhanced translational efficiency was flanked by the attB and attP sites in a head-to-head orientation and further linked in a reverse orientation to a DsRed reporter gene. The coexpression of a C-terminal modified phiC31-NLS integrase carrying a simian virus 40 (SV40) nuclear localization signal (NLS) effectively flipped the BmAct4 promoter through an attB/attP exchange, thereby activating the downstream expression of DsRed in a silkworm embryo-derived cell line, BmE. Subsequently, the FLIP system, together with a system continuously expressing the phiC31-NLS integrase, was used to construct binary transgenic silkworm lines. Hybridization between FLIP and phiC31-NLS transgenic silkworm lines resulted in the successful flipping of the BmAct4 promoter, with an approximately 39% heritable transformation efficiency in silkworm offspring, leading to the constitutive and high-level expression of DsRed in silkworms, which accounted for approximately 0.81% of the silkworm pupal weight. Our successful development of the FLIP system offers an effective alternative for manipulating gene expression in silkworms and other lepidopteran species.     

人era真核表达载体的构建

Era是一个独特的含有RNA结合KH结构域的G蛋白亚家族,哺乳类era新近被克隆,目前还没有关于其功能的研究报道。构建了带流感病毒血凝素9肽表位标签（HA tag）的野生型人era基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养细胞CHO,Western blot鉴定表明目的的基因得到表达。为深入探讨人era基因的功能奠定了坚实的基础。     

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达情况。方法：对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切（XhoI和BamHI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果：测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论：成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

人HCN2 真核表达载体的构建及在HEK293 细胞中的表达

目的:构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达情况。方法:对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切(XhoI和BamHI)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果:测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论:成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

转基因鸡生物反应器载体的构建及其表达特性分析

以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因,构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体,以巨细胞病毒 (Cytomegalovirus,CMV)启动子表达载体为对照,转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞,通过荧光和酶活性检测,旨在筛选出用于实现转基因鸡生物反应器的高效特异性表达载体。结果发现,鸡卵清蛋白启动子表达载体转染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,没有表现出明显的细胞特异性,且荧光素酶检测结果表明其在各细胞组中表达活性都低于CMV启动子表达载体100倍以上;慢病毒载体感染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,在鸡输卵管上皮细胞组感染单个细胞的病毒颗粒 (Multiplicity of infection,MOI) 为20时绿色荧光蛋白表达量就可以达到CMV启动子表达载体的水平。上述结果表明,基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达,而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。     

骨形态发生蛋白-7真核表达载体的构建及鉴定

从转录水平上对原有载体进行改造,以期提高外源蛋白的表达量,为进一步研究改建载体后蛋白表达量奠定基础。将pBI—EGFP载体上的反应元件Pbi-1切下,连在pTet-On载体上PCMV的下游;然后将外源基因BMP-7重组到原有的pBI—EGFP载体内,进行酶切和序列鉴定。成功地构建了pTet—0n—Pbi-1载体和其核表达载体pBI／BMP—7。     

口蹄疫病毒VP1高效植物表达载体构建及鉴定

采用高保真PCR方法从pGEM-VP1-T质粒扩出VP1基因,定向克隆到含DHA的融合中间载体pUC18-DHA,得到pUC18-VP1-DHA,经测序证实核酸序列正确后,再亚克隆到转化范围广,转化效率高,且含有双增强子的高效植物双元表达载体pGreen0029-GFP上,获得含VP1融合DHA基因的植物双元表达载体pGreen0029-VP1-DHA,采用电击法将含VP1的植物表达载体转入根癌农杆菌G3101中,获得了含VP1基因的双元植物表达载体,为下一步的广范围转基因植物表达研究奠定了基础。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。