表面等离激元共振生物传感器研究整合素蛋白αⅡbβ3与RGD多肽的特异结合

整合素蛋白αⅡbβ3是血小板上的一种钙依赖性膜受体,其胞外结构域可与含有RGD序列的肽链特异结合.通过将含有NTA-DOGS的磷脂单分子层膜转移到50 nm厚的金膜上,制备了一种含有NTA头部的表面等离激元共振(SPR)传感器敏感膜.设计并合成了含有6个组氨酸和RGD基团的His-tagged短肽P1,并利用SPR生物传感器,对整合素蛋白与含有RGD配基的支撑平面膜的特异相互作用以及Ca2+、Mn2+对该相互作用的影响进行了研究.结果表明,NTA敏感膜能很好地将P1锚定在支撑平面膜表面,并能够保证P1维持一个有效的定向.将Ca2+从低结合位点去除或加入Mn2+都能够增加整合素蛋白的配基结合活性.二价阳离子对整合素蛋白配基结合能力的调节作用,可能在整合素发挥其生理功能的过程中具有重要的意义.     

胞外ATP对AlCl3诱导的细胞死亡过程中胞内H2O2和Ca2+水平的影响及其生理机制分析

该实验以烟草悬浮细胞 BY 2 为材料,在烟草悬浮细胞中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20 mmol·L^-1AlCl₃,以等体积去离子水处理的悬浮细胞液为对照,并依据前述实验结果选择0.15 mmol·L^-1 AlCl₃,分别添加5 mmol·L^-1 DMTU(H₂O₂ 抑制剂)、20 μmol·L^-1CaCl₂、15 μmol·L^-1 LaCl₃(Ca²⁺通道抑制剂)和50 μmol·L^-1 ATP设计多项处理,分析胞外ATP(eATP)对铝离子(Al³⁺)胁迫引起的植物细胞死亡及其胞内H₂O₂、Ca²⁺的影响,以揭示Al³⁺胁迫下植物调节细胞死亡的可能机制,进一步扩展对eATP功能的认知。结果显示：(1)随着 AlCl₃ 胁迫浓度的提高,细胞死亡水平和胞内H₂O₂水平上升,而胞内Ca²⁺和eATP水平则逐渐降低。(2)外援施加H₂O₂抑制剂 DMTU(二甲基硫脲)和Ca²⁺能够有效缓解AlCl₃诱导的细胞死亡水平的上升;而Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃(三氯化镧)则加剧了AlCl₃胁迫下的细胞死亡。(3)在AlCl₃胁迫下对细胞添加外源ATP,能够缓解AlCl₃胁迫下胞内H₂O₂水平上升和Ca²⁺水平下降的同时,并显著降低AlCl₃胁迫导致的细胞死亡。研究表明, Al³⁺以剂量依赖的模式提升细胞死亡和细胞内H₂O₂的水平并降低胞内Ca²⁺和eATP水平,AlCl₃诱导的细胞死亡受到H₂O₂和Ca²⁺水平变化的调节,eATP可以通过调节H₂O₂与Ca²⁺水平缓解AlCl₃诱导的细胞死亡。推测Al³⁺胁迫可能通过抑制钙离子通道而破坏了细胞内H₂O₂和Ca²⁺之间的协同关系,外源ATP对Al³⁺诱导H₂O₂上升的缓解作用可能是由于其提升了细胞的抗氧化能力。     

肺腺癌A549/DDP细胞周期变化及其多药耐药性

用Fura-2/AM标记药物敏感的肺腺癌细胞A₅₄₉和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A₅₄₉/DDP两种细胞胞内游离Ca²⁺,用碘化丙锭(PI)标记细胞DNA,检测其胞内Ca²⁺的变化及两种细胞增殖能力和细胞周期.实验结果表明,抗药性细胞株A₅₄₉/DDP胞浆内游离Ca²⁺的浓度仅为药物敏感细胞株A₅₄₉的1/3左右,同时前者的细胞增殖能力较后者明显增强,而且细胞周期也明显缩短.当用BAPTA-AM和EGTA或A₂₃₁₈₇和Thapsigargin处理细胞以降低或升高其胞内自由Ca²⁺浓度时可改变细胞的生长周期,二者也呈现明显差别.这些结果表明,对顺铂产生耐药性的人肺腺癌A₅₄₉/DDP细胞胞内Ca²⁺浓度的降低,可能影响细胞的增殖,缩短细胞的生长周期,特别是影响起决定作用的G1期,从而有利于肿瘤细胞多药耐药特性的维持.     

Mg2＋对阿霉素引起心肌线粒体F1F0变化的保护

抗肿瘤药物阿霉素(ADM)对心肌线粒体F₁F₀-复合体呈现抑制而对F₁-ATPase无抑制,这表明ADM可能是通过膜脂起作用的,适当浓度Mg²⁺能降低ADM对复合体的抑制.经 ³¹P-NMR和标记荧光探针NBD-PE,DPH,MC-540以及内源荧光等的测定,结果表明ADM可能首先通过诱导F₁F₀膜脂形成非双层脂结构,继而影响了膜脂的堆积程度和流动性,进而引起F₁F₀-复合体酶蛋白构象的改变,最终导致酶活力的降低.Mg^2＋则可能由于与ADM竞争与心磷脂的结合,而对ADM引起F₁F₀的变化产生保护作用.     

亚硒酸钠对巨噬细胞内游离Ca2+和Mg2+的影响

用单细胞阳离子测定系统研究了SeO^2-₃对巨噬细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的影响.实验结果表明:SeO^2-₃高于10^-4mol/L时,有显著的细胞毒性.SeO^2-₃对细胞的毒性作用使细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的浓度升高但Ca²⁺浓度的升高速率比Mg²⁺快.还有,高于10^-4mol/L的SeO^2-₃对红细胞膜上的Ca²⁺-ATP酶活性有明显抑制作用.     

酵母tRNAAla中修饰核苷酸T54,Ψ55的生物功能

酵母tRNA^Ala的3′半分子与一个11聚的DNA片段(5′GGAATCGAACC3′)杂交后用RNase H酶解,该酶能在Ψ₅₅的3′侧定点剪切,这样就制备得片段C₃₆-Ψ₅₅该片段经1～2个高碘酸氧化和β-消去得片段C₃₆-T₅₄和C₃₆-G₅₃机器合成了3个酵母tRNA^Ala的片段,分别j是片段C₅₆-A₇₆,U₅₅-A₇₆(以U替代Ψ₅₅)和U₅₄-A₇₆(以UU替代T₅₄Ψ₅₅).合成和制备的片段以适当的组合用T₄RNA连接酶连接,产物是酵母tRNAtRNA^Ala的3′半分子或其类似物.3种3′半分子或其类似物分别与天然5′半分子连接得重组天然酵母tRNA^Ala(tRNAr)和2个酵母tRNA^Ala的类似物:(1)tRNAa(以U替代Ψ₅₅),(2)tRNAb(以UU替代T₅₄Ψ₅₅).体外测定了它们的丙氨酸接受活力和参入活力,发现酵母tRNA^Ala的类似物tRNAa和tRNAb与天然重组酵母tRNA^Ala相比,它们的氨基酸接受活力分别降低了25%和55%,参入活力分别降低了35%和30%.说明酵母tRNA^Ala中的修饰核苷酸T₅₄和Ψ₅₅对该tRNA的功能有重要的影响.     

GM3抑制人白血病J6－2细胞肌醇磷脂代谢循环

采用无载体 ³²P和[ ³H]肌醇标记磷脂,观察了促分化剂神经节苷脂GM₃对人单核样白血病J6-2细胞肌醇磷脂代谢的影响.GM₃抑制[ ³²P]Pi和[ ³H]肌醇掺入J6-2细胞磷脂酰肌醇(PI),促进[ ³²P]Pi和[ ³H]肌醇掺入磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP₂),抑制[ ³²P]Pi掺入磷脂酸(PA),抑制[ ³H]肌醇掺入三磷酸肌醇(IP₃).GM₃的上述作用均为浓度依赖性的,随GM₃浓度的提高而增强.上述结果表明,GM₃抑制J6-2细胞的肌醇磷脂代谢循环.     

猪脑突触体质膜(Ca2+-Mg2+)-ATPase的分离纯化与性质

以猪脑为材料,经匀浆、差速离心、蔗糖密度梯度离心分离突触体. 低渗破膜得到突触体膜. Triton X-100增溶后,经钙调蛋白亲和层析可得去脂的质膜Ca²⁺-ATPase. 用大体积亲和柱和大体积低Ca²⁺淋洗液淋洗,可得产率、纯度和活性均较高的质膜Ca²⁺-ATPase. 与大豆磷脂保温后,去脂的Ca²⁺-ATPase的水解活力可恢复达3.32 μmol/(mg·min).SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显示单一蛋白质带,分子质量约为140 ku,纯度在90%以上. 不同Ca²⁺浓度明显影响酶的活力.     

血红蛋白A2现象发生机制的研究——“红细胞HbA2”为HbA2与HbA的结合产物

为了弄清血红蛋白A₂现象的发生机制,我们对“红细胞HbA₂”的化学组成进行了分析。“红细胞HbA₂”的双向电泳结果表明,它含有两种血红蛋白成分:一种相当于HbA,另一种很可能是溶血液HbA₂。其单向二次电泳结果也证明,它是由溶血液HbA₂和HbA所组成。结果初步说明,盘红细胞中HbA₂可能与HbA结合存在。两者可能有相互作用,也许这是产生血红蛋白A₂现象的原因。     

河豚毒素和Cd2+对Zn2+诱发爆发波放电的影响

本文用微电极细胞内电位记录、通道阻断剂和放射性同位素等技术发现,锌离子可诱发爆发波放电(BD),钠通道阻断剂——河豚毒素对BD无效应,而钙通道阻断剂——Ca²⁺则可使BD消失,Cd²⁺可使[⁶⁵Zn²⁺]_i量减少。以上结果说明,Zn²⁺诱发BD的产生机理很可能是Zn²⁺代替Ca²⁺通过钙通道进入胞内引起的。     

脱硫废弃物对碱胁迫下油葵幼叶细胞钙分布及Ca2+-ATPase活性的影响

利用脱硫废弃物改良盐碱地对于确保国家粮食安全和生态安全,发展循环经济具有重要意义。为了探索脱硫废弃物提高植物抗盐碱机理,采用盆栽试验法, 研究了施入不同量脱硫废弃物和CaSO₄对碱胁迫下油葵叶片细胞钙分布、总钙含量以及质膜和液泡膜Ca²⁺-ATPase活性的影响。结果表明:在碱胁迫下(CK),Ca²⁺与焦锑酸钾结合成黑色颗粒成团零星分布于叶绿体和液泡中,叶绿体超微结构受到不同程度的破坏。施入脱硫废弃物和CaSO₄,叶绿体结构完整,细胞间隙、细胞壁和液泡中的钙颗粒逐渐增多,同时,质膜和液泡膜Ca²⁺-ATPase活性随脱硫废弃物和纯品硫酸钙施量的增加而增加,其中液泡膜Ca²⁺-ATPase活性无论是对照(CK)还是处理的活性均高于质膜Ca²⁺-ATPase活性。叶片细胞内总钙含量也随脱硫废弃物和CaSO₄施用量的增加呈升高趋势。说明脱硫废弃物和CaSO₄通过增加Ca²⁺-ATPase活性,有利于钙通过质膜和液泡膜进入细胞内,维持膜结构的稳定性,缓解碱对油葵的胁迫。     

邻二氮菲－Fe2＋氧化法检测H2O2／Fe2＋产生的羟自由基

报告检测H₂O₂/Fe^2＋所产生羟自由基的新方法. 羟自由基氧化反应后, 邻二氮菲-Fe^2＋的A₅₃₆明显下降, 且△A₅₃₆与邻二氮菲, FeSO₄及H₂O₂呈量效关系, 随反应时间延长, △A₅₃₆依幂函数规律上升. 此法试验结果表明, 甘露醇, 抗坏血酸及硫肥清除羟自由基作用呈明显的量效关系.     

大鼠海马CA1区锥体细胞上一种Ca2+依赖性KATP通道

K_ATP通道在细胞的新陈代谢与膜兴奋性的耦联中起重要作用.采用膜片钳的内面向外式记录方法,在成年大鼠海马CA1区锥体细胞上记录到一种被胞浆侧ATP和甲糖宁（tolbutamide,一种K_ATP通道阻断剂）抑制的Ca²⁺依赖性钾离子通道.在细胞膜内外的K⁺浓度均为140 mmol/L时,通道的电导为(204±21) pS,翻转电位为(3.57±1.13) mV,通道无整流性.通道开放概率及ATP对通道的抑制作用均呈现电压依赖性.该K_ATP通道与以往报道的“经典”K_ATP通道有显著不同,其活动受膜电位、胞内Ca²⁺和ATP三重调节,表明这是一种新型的K_ATP通道.上述结果表明在海马神经元上至少有两种性质不同的K_ATP通道,提示神经元可能通过不同性质的K_ATP通道感受细胞内的代谢状态,进而调节细胞膜的兴奋性.     

锌7与镉7－金属硫蛋白清除羟自由基的比较

分离及纯化兔肝金属硫蛋白.制备去金属金属硫蛋白、锌₇与镉₇金属硫蛋白．在不同pH条件下,比较后二者清除羟自由基能力;在pH6条件下,比较锌₇－金属硫蛋白与有关蛋白和无机锌盐清除羟自由基效果．结论是在近生理pH条件下锌₇－金属硫蛋白清除羟自由基能力远强于镉₇－金属硫蛋白．金属硫蛋白清除羟自由基的能力主要来源于蛋白中处于还原态的流基．     

HIV/AIDS患者抗病毒治疗前HIV-1耐药情况调查及外周血CD8+T细胞CD38表达水平研究

摘要 目的：分析人免疫缺陷病毒/艾滋病（HIV/AIDS）患者抗病毒治疗前HIV-1耐药以及影响因素,探讨HIV/AIDS患者外周血CD₈⁺T细胞CD₃₈表达（CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比）与CD₄⁺T淋巴细胞计数的相关性。方法：选择2016年3月至2019年12月我院接诊的442例HIV/AIDS患者（HIV/AIDS组）和163例同期于我院进行体检的健康志愿者（对照组）,HIV/AIDS组扩增pol基因,进行HIV-1基因耐药分析,检测CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比、CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数。分析HIV/AIDS患者HIV-1耐药的影响因素,分析CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比与CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数相关性。结果：HIV/AIDS组442例HIV/AIDS患者中376例获得HIV-1 pol基因序列,HIV-1耐药35例,耐药率9.31%（35/376）。单因素分析结果显示耐药组和非耐药组在年龄、文化程度、感染途径、HIV病毒载量方面差异有统计学意义（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示同性性传播、注射吸毒、高HIV病毒载量是HIV/AIDS患者抗病毒治疗前HIV-1耐药的危险因素（P＜0.05）。HIV/AIDS组外周血CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数低于对照组（P＜0.05）,CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比高于对照组（P＜0.05）。CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比与CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数呈负相关（P＜0.05）。结论：抗病毒治疗前HIV/AIDS患者存在一定HIV-1耐药率,传播途径、HIV-1病毒载量与HIV-1耐药有关。CD₈⁺T细胞表面CD₃₈过表达与HIV/AIDS 患者CD₄⁺T T细胞的过度消耗有关。     

豚鼠精子质膜Ca2+ -ATPase活性与精子顶体反应关系的研究

用生化测定法首次证实豚鼠精子质膜Ca²⁺-ATPase活性在精子获能和顶体反应过程中显著下降.Ca²⁺-ATPase抑制剂利尿酸(ethacrynic acid)抑制质膜Ca²⁺-ATPase活性,但钙调素(50μg/mL)的拮抗剂三氟拉嗪(TFP,200～500μmol/L)对该酶活性没有影响,说明钙调素不直接参与精子依赖于ATP的Ca²⁺的主动泵出.但钙调素与精子的Ca²⁺内流有关,钙调素拮抗剂TFP显著促进精子顶体反应和精子对Ca²⁺的摄入.Ca²⁺-ATPase抑制剂栎皮酮(quercetin)、原钒酸钠(sodiumorthovandate)、利尿磺胺(furosemide)和利尿酸均显著促进豚鼠精子的顶体反应,但却抑制精子对Ca²⁺的摄入,这无法用它们对质膜Ca²⁺-ATPase活性的抑制作用解释.推测这可能是由于Ca²⁺-ATPase抑制剂在抑制质膜Ca²⁺-ATPase活性的同时也抑制了顶体外膜或线粒体外膜上的该酶的活性,导致Ca²⁺在细胞质内的积累,进而通过负反馈机制抑制Ca²⁺进一步内流所致.另外,Ca²⁺-ATPase抑制剂对糖酵解的抑制作用也可能是Ca²⁺在细胞质中积累和抑制精子Ca²⁺摄入的原因.     

Ca2+参与水霉菌丝细胞壁修饰的证据

以细胞壁崩溃酶-Driselflse短时间处理水霉(Saprozegma ferax)菌丝,pH5．0时可使原生质从菌丝亚顶端喷出,pH6．0～8．0时则不导致该现象发生;适当浓度EGTA的存在,可提高pH5．0时酶解引起的原生质喷出频率、使pH6．0～8．0时生长菌丝的顶端原生质也喷出、并且喷出多发生在菌丝最顶端;外加CaCl₂．不抑制菌丝顶端原生质的喷出,排除了Ca²⁺抑制酶活性的可能。随后的跟踪观察显示,长时间以缺Ca²⁺培养介质培养菌丝,同样能够导致菌丝顶端原生质喷出。上述研究结果表明,培养介质中Ca²⁺和H⁺对菌丝完整性的维持起调节作用,细胞壁上的Ca²⁺可能参与了水霉菌丝细胞壁物理特性的修饰。     

神经节苷脂GM3对J6－2细胞蛋白质磷酸化的影响

通过研究神经节苷脂GM₃对国人单核样白血病细胞系J6-2细胞蛋白质磷酸化的影响,在[γ- ³²P]ATP,GM₃,ATP,Mg²⁺与J6-2细胞液及颗粒两部分共同反应,10min(30℃)体系中,观察到GM₃对两部分蛋白质磷酸化的调节作用.GM₃(100μmol/L)促进颗粒部分分子量为180 000,87 000,78 000,67 000,43 000及31 000的蛋白质磷酸化,促进胞液部分分子量为87 000及56 000的蛋白质磷酸化,而且能抑制70 000及43 000蛋白质磷酸化.由于GM₃已被前人证实能对J6-2细胞起分化作用,其作用时间长达4-6d,很可能GM₃对蛋白质磷酸化作用的调节是GM₃促分化作用的早期信号.     

脉冲电场对粒细胞内Ca2+浓度影响的动态变化

利用激光共聚焦扫描显微镜和装有CCD系统的荧光显微镜 ,研究在单脉冲电场作用下经fluo 3/AM标记的鸡胚小脑粒细胞内自由Ca²⁺浓度 ( [Ca ²⁺]_i)的动态变化过程 .结果表明 :在单个电脉冲作用下 ,细胞内Ca²⁺浓度立刻升高并达到其最大值 .Ca²⁺浓度升高的幅度以及升高的速率具有电场强度的依赖性 .当细胞外Ca²⁺被过量的EGTA络合或细胞膜上的Ca²⁺通道被La ³⁺堵塞后 ,细胞内的Ca²⁺浓度仍然升高 .细胞内不同区域的Ca²⁺浓度同时升高 ;两极内的Ca²⁺浓度早于胞体的Ca²⁺浓度达到最大值并迅速恢复 .     

亲和层析纯化肌质网Ca2+－ATP酶

建立了一种亲和层析纯化肌质网Ca²⁺-ATP酶的方法．用非离子型去污剂C₁₂E₈ 溶解肌质网,再通过反应红－120琼脂糖亲和层析柱使肌质网Ca²⁺-ATP酶纯度从粗品中的65％提高到99％,并具有较高ATP水解活性．经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,为电泳纯．