丁氏双鳍电鳐电器官乙酰胆碱受体膜微囊的分离

本文报告了从丁氏双鳍电鳐电器官中分离纯化膜结合烟碱样乙酰胆碱受体的简便方法。比活性达1750nmolα-毒素结合点/克蛋白质,无乙酰胆碱酯酶活性,可避免它的干扰。电镜检查发现受体的膜结合物成微囊状,直径约0.1—0.3μα-毒素结合试验及聚丙烯酰胺凝胺电泳结果证明具有烟碱样胆碱能受体性质,适于受体功能和性质的研究。     

丁氏双鳍电鳐(Narcine timlei)电器官烟碱型乙酰胆碱受体(AChR)某些生化性质的研究

本文报道了丁氏双鳍电鳐（Narcine timlei）电器官烟碱型乙酰胆碱受体蛋白（AChR）的某些生化性质。纯化的AChR经聚丙烯酰胺梯度（4％—30％）凝胶电泳,呈现一个主要蛋白带,经测定,表观分子量为440,000,与~（125）I-α-Bgt-AChR复合物的分子量相一致。等电聚焦电泳测得纯化AChR和~（125）I-α-BgtAChR的等电点（pI）分别为4.9和5.2;经SDS—聚丙烯酰胺梯度（4％—30％）凝胶电泳,纯化的AChR解离成三个主要亚基蛋白带,它们的表观分子量分别为38,000,42,000和66,000,其中前两个亚基的含量很高,约占总数75％。氨基酸组成分析表明,丁氏双鳍电鳐电器官AChR由18种氨基酸组成,（色氨酸未测定）,其中酸性氨基酸含量很高,占总数的20％以上,说明纯化的AChR是一个复杂结构的酸性蛋白大分子。     

α-银环蛇毒素基因的克隆与表达

与传统的捕蛇或养蛇提毒的方法相比,利用基因工程方法生产蛇神经毒素具有明显的潜在优势。本研究结合国内外的研究现状,以α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)为例子来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其DNA序列并设计成部分互补的4条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化其寡核苷酸片段,通过片段退火、切口补平、连接、克隆、测序鉴定获得了α-银环蛇毒素基因;然后将α-银环蛇毒素基因克隆至pGEX-2T质粒中分别转化大肠杆菌DH5(和JM109进行表达分析,融合蛋白约占细菌总蛋白的30％～40％,其中部分为可溶性表达,部分以包含体的形式表达;对可溶性表达的条件进行了优化。最后以天然纯化的α-银环蛇毒素作为对照,分析融合方式表达的重组α-银环蛇毒素的活性,ELISA结果显示其与天然的α-银环蛇毒素比较具有相似的抗原性。     

不同地区舟山种和孟加拉种眼镜蛇的神经毒素

先前的工作发现 ,眼镜蛇孟加拉种的神经毒分布存在明显的地理差异 ,但是导致这种现象的原因还不是很清楚。该工作首先采集夏季的眼镜蛇种 ,进行分类学的鉴定 ,以排除因为种属分类、季节和年龄而导致的不确定因素对蛇毒成分产生影响。再从鉴定好的成年浙江舟山种和云南孟加拉种眼镜蛇蛇毒中分离获得短链神经毒素 ;同时采用RT PCR方法得到相应的基因。结果从浙江舟山种眼镜蛇蛇毒中分离到两个神经毒素 ;从云南孟加拉种蛇毒中得到三个神经毒素。这些神经毒素都是短链神经毒素。说明该两个蛇种与已经报道的台湾及浙江的舟山种眼镜蛇很相似 ,蛇毒中都以短链神经毒素为主。另外泰国孟加拉种眼镜蛇蛇毒中则以长链神经毒素为主。这种现象很难用种群发生的前后或者地理距离的长短来解释 ,而可能与地区间的气候、地理环境或者眼镜蛇的食物差别相关。实验统计表明在云南、浙江和台湾这些条件基本相似 ,而泰国就有很大的不同。     

银环蛇神经毒素的生物信息学研究

目的为银环蛇神经毒素的研究及应用提供生物信息学视角的分析,并对其应用提出展望。方法在总结前人研究成果的基础上,运用生物信息学相关数据库及软件,对银环蛇神经毒素两类主要蛋白的三维结构,及其与乙酰胆碱和乙酰胆碱受体之间的相互作用机制进行相关分析研究。结果通过生物信息学分析,得到了银环蛇神经毒素的氨基酸序列及其三维结构图像,对此神经毒素的作用机制在分子水平有了更清楚的认识。结论运用生物信息学方法进行生物大分子研究,能取得较好的分析结果。     

乙酰胆碱结合蛋白的特点及应用

乙酰胆碱结合蛋白(acetylcholine-binding proteins,AChBPs)的基本特征、结构特点和激活机制与烟碱型乙酰胆碱受体(the nicotinic acetylcholine recepror,nAChRs)相似.通过对AChBPs晶体结构与功能的研究,能准确阐明nAChRs结构与功能的关系.通过对配体和AChBPs的复合物的晶体结构解析,有助于我们理解配体与nAChRs相互作用的机理,为开发治疗疼痛、成瘾、帕金森症、阿尔茨海默氏症和癫痫等疾病的新药提供理论基础.     

α-银环蛇毒素和β-银环蛇毒素的研究进展

银环蛇属动物界,脊索动物门,爬虫纲,有鳞目。眼镜蛇科,环蛇属。全身背面是黑白相间的环纹,具30～50个白色或乳黄色窄横纹。是世界十大毒蛇之一。属前沟牙类毒蛇,其一次排毒4．6mg,1mg干毒就能致人于死地。毒腺分泌的蛇毒含多种多肽成分,具有不同的生物学活性。     

二化螟乙酰胆碱受体α亚基的基因克隆与序列分析

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)在昆虫的兴奋性突触传递中起着重要的作用,同时也是杀虫剂作用的重要靶标。近年来,二化螟对作用于昆虫nAChR的沙蚕毒素类杀虫剂杀虫单产生了高抗性。为了研究可能存在的靶标不敏感机制,我们采用RT-PCR技术,对二化螟nAChR-α亚 基全长cDNA进行了分子克隆。序分析表明,这是1个新的α亚基基因,定名为Cs α 1。基 因全长为1997个核苷酸,包含了1个开放阅读框,编码1个509氨基酸的成熟蛋白和1个24氨基酸的信号肽。Cs α 1与其他昆虫nAChR α亚基之间有52%-94%的同源性,高于与脊椎动物nAChR α亚基之间的同源性。     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

纯化眼镜蛇毒蛋白对乙酰胆碱受体通道的阻断作用

在培养的抓蟾胚胎神经和肌肉细胞上用膜片箝技术研究了从中国华南产眼镜蛇毒分离出的神经毒组分对乙酰胆碱受体（ＡＣｈ－Ｒ）通道的影响,发现它在微终板电位和单通道水平上都有明显的阻断作用。完全阻断神经肌肉接点传递的剂量约为２．０μｇ／ｍｌ,对乙酰胆碱受体通道的半阻断量约为０．２３μｇ／ｍｌ。这表明它与α－银环蛇毒有相似功效。     

金环蛇类心脏毒素对两栖类肌肉膜电常数的影响

前一工作表明,从我国广东产金环蛇毒分离的类心脏毒素(即毒素 A 和 B)在一定浓度下引起两栖类和哺乳类动物的心肌,特别是骨胳肌的膜电位持续下降。本工作试图分析这种下降的机制。实验表明在毒素 A 或 B 的作用下,随着蟾蜍骨胳肌膜电位的下降,膜电阻也明显下降,但膜电容保持不变。这种膜电位的下降,不能为预先向溶液中加河豚毒素所防止,也不能为无钠溶液所延缓。这些结果提示,毒素 A 和 B 是通过增加可兴奋膜的通透性,而不是由阻塞 K~ 通道来引起膜电位下降的,也不是或主要不是通过 Na~ 通透性的增加而实现的。     

金环蛇毒膜活性多肽B在脂双层中形成离子通道的作用

利用由卵磷脂和胆固醇(分别为20和5mg/ml)的正癸烷溶液形成的平板脂双层,观察了由金环蛇毒纯化的膜活性多肽B(BMAP B)形成通道的作用。实验结果表明,在膜两侧有一定电位差或盐浓度梯度的条件下,BMAP B参入脂双层形成离子通道,在电压箝位下可记录出不同电导的单位电导涨落,随着更多通道的形成,脂双层稳态膜电阻明显降低;通过在不对称盐溶液中测定平衡电位,确定BMAP B通道的阴阳离子选择性不强,P_K/P_Cl≈1.4;和在生物膜的作用一样,二价金属离子Ba~(2+),Ca~(2+)抑制BMAP B通道的活动。这些结果为金环蛇毒膜活性多肽在生物膜的去极化作用提供了解释。     

THE BINDING OF ACETYLCHOLINE TO SYNAPTIC VESICLES FROM TORPEDO CALIFORNICA ELECTROPLAX

Abstract— The in vitro uptake of exogenous acetylcholine by isolated presynaptic vesicles has been demonstrated in a new system. A preparation of vesicles from Torpedo californica electroplax was developed in which acetylcholinesterase and acetylcholine receptor activity were blocked. The vesicles bound acetylcholine with K_d 1.58 μM, the maximum amount bound being 26 pmol per g of original tissue, or 52 molecules per vesicle. Nicotinic drugs blocked binding, but muscarinic and noncholinergic drugs did not. The relative potency of nicotinic drugs differed greatly from their potency on Torpedo receptor. Sephadex chromatography showed that 26% of the binding was irreversible. The relationship of the binding to acetylcholine uptake and storage was discussed.     

THE CATION SENSITIVITY OF THE ACETYLCHOLINE RECEPTOR FROM TORPEDO CALIFORNICA

—The effects of various cations and cholinergic ligands on the rate of α-bungarotoxin-acetylcholine receptor complex formation has been studied by means of a DEAE-cellulose disk assay technique. The reaction rate is reduced to one half the initial rate in the presence of 2·5 · 10^?6m acetyleholine. a value close to the observed K_D of ACh measured by equilibrium dialysis. Inhibition constants of about 5 mM were obtained for most monovalent cations whereas divalent cations gave inhibition constants of 0·05-0·2 mm . The rate and extent of toxin-receptor complex formation was also investigated as a function of hydrogen ion concentration; the rate of formation reaches a maximum at pH 7·5 and a group with a pK about 6 inhibits toxin binding to the receptor when protonated. These data can be correlated with the observed effects of inorganic cations on the binding of cholinergic ligands in vivo at the neuromuscular junction. Given the affinities of the individual cations, it is possible to predict how the apparent affinity of a cation-sensitive cholinergic ligand will change with variations of buffer composition.     

SEPARATION OF NEUROTOXINS FROM HORNET (VESPA INSULARIS) VENOM AND THEIR ACTIONS ON CRUSTACEAN NEUROMUSCULAR TRANSMISSION

Abstract— The venom of homet ( Vespa insularis) was separated into three components by gel filtration on Sephadex G-50, Sephadex G-25 and Sephadex G-10. The effect of each component on crustacean neuromuscular junctions was studied electrophysiologically using intracellular recordings. Two components (Fractions D and E) suppressed the postsynaptic potentials; Fraction D preferentially depressed excitatory postsynaptic potentials (epsps) without affecting inhibitory postsynaptic potentials (ipsps), and fraction E depressed both epsps and ipsps with concurrent decrease in membrane resistance. Another component (fraction F) augmented both epsps and ipsps. Fractions D and F were possibly acting presynaptically while fraction E was acting on the postsynaptic membrane. The active substances in fraction D, E and F were separated on TLC and the active substance in fraction F was confirmed to be serotonin. The active substances in fractions D and E are assumed to be peptides from the results of peptidase digestion. The effect of fraction D was degraded by treatment with trypsin but not by chymotrypsin nor carboxypeptidase A and B. On the other hand, the effect of fraction E was degraded by chymotrypsin and carboxypeptidase B but not by trypsin nor carboxypeptidase A.     

BINDING OF MUSCARONE BY EXTRACTS OF HOUSEFLY BRAIN: RELATIONSHIP TO RECEPTORS FOR ACETYLCHOLINE

The supernatant fluid fraction isolated by centrifugation from a homogenate of heads of houseflies bound muscarone reversibly, with a binding constant of 2·4 × 10^?6m and an amount of 70 nmol/g of protein. Studies with 28 drugs demonstrated strong blockade by the 17 cholinergic agents, suggesting both nicotinic and muscarinic characteristics in the mode of binding. The binding appeared to involve acetylcholine receptors.     

去卵巢大鼠Ru 486与垂体及子宫内膜孕激素受体结合的比较

经雌激素诱发的去卵巢大鼠在肌肉注射不同量的 Ru486(0.1mg/kg—2mg/kg)之后,垂体及子宫内膜的胞液游离孕激素受体结合位点随着 Ru486注射量的升高而逐步下降。注射 Ru486 2mg/kg 30min 后,此两组织中孕激素受体的结合位点就明显降低,2h 降到最低点,3h 开始恢复。以上实验说明 Ru486进入机体即可分别占领垂体及子宫内膜的孕激素受体的结合位点。然而 Ru486对此二组织的孕激素受体的结合作用并不完全相同,似乎子宫孕激素受体更易为 Ru486所占位,而解离也快。