人t-PA溶栓突变体的研究进展

人t-PA在机体循环中的纤溶系统中起重要作用,是一种内源性溶血栓因子,t-PA蛋白分子可直接用于溶栓治疗,但天然的t-PA分子在体内半衰期短,极最被清除,因而限制其广泛应用,根据它的结构特点而改造的一系列t-PA变体分子将成为新一代溶栓药物,在溶栓治疗中广泛应用。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体FrGGI的构建、表达及特性分析

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAI—1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术成功地构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44～Ser50置换为纤粘蛋白Ⅰ型F区间连接序列GluSerLysProGluAlaGluGlu的t-PA的组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,FrGGI在大鼠血浆中的半衰期延长了15倍,特异活性提高了40％,并获得了PAI-1抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。     

t-PA突变体的构建、表达及生物学特性分析

t-PA是纤溶系统的生理性激活剂,但它在血浆中半衰期甚短及活性可被天然快速抑制剂PAI-1抑制等生理特性成为其作为临床溶栓剂的主要缺陷。为了研制新型t-PA溶栓剂,本文根据t-PA结构与功能研究的最新信息,针对延长t-PA半衰期、提高特异活性及引入PAI-1抗性等,设计并构建了8种t-PA突变体。进而在COS-7及CHO细胞中进行了表达研究,并对突变体表达产物的特性进行了分析和评价。     

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)因其在防止血栓形成中起重要作用而受到人们的重视。但由于t-PA在血液中半衰期很短,作为溶栓药,一时难于推广。为了延长半衰期、增强其特异活性,本组构建了t-PA突变体并在CHO-dhfr~-细胞中获得了高效表达。我们在细胞培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定、染色,进行染色体分析,结果表明,t-PA工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒。四倍体、裂隙、断片,畸变率为15％,属于正常范围。同时我们对该细胞系进行成瘤性试验,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以Hela细胞为阳性对照,CHO-dhfr~-细胞为阴性对照,试验表明:t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。     

t-PA蛋白质分子的改造

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)与纤维蛋白有高亲和力,具有特异地溶解血栓的功能。t-PA含有多个结构域,其分子结构和功能关系的阐明,促进了改造t-PA分子以发展更特异的血栓溶解剂的研究。     

一种由藤黄微球菌产生的纤溶酶

血栓栓塞性疾病如心肌梗塞、脑栓塞等是危害人类健康、导致死亡率最高的疾病之一.全球每年约1 700万人死于心脑血管病,我国每年约有300万人死于此类疾病.治疗此类疾病的主要手段之一是溶栓疗法,即注射溶栓剂疏通血管,但传统的溶栓药物如t-PA、尿激酶等有半衰期短、使用量大、价格昂贵、易引发出血症等不良副作用,因此开发新型溶栓类药物,提供廉价高效、副作用小、使用方便的溶栓药物,对栓塞性疾病的治疗具有重要意义.     

肌注组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内表达

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是人体内重要的丝氨酸蛋白酶,它能特异地激活血栓中的纤溶酶原,使之成为具有溶解纤维蛋白能力的纤溶酶,临床上将提纯的t-PA作为心血管栓塞性疾病急救和康复治疗的首选药物。由于t-PA在天然材料中含量甚微,难以大量制备,基因工程产品产量有限,临床应用货源紧缺且价格昂贵。为探索心血管疾病的基因治疗和预     

一种潜在的溶栓药物--纳豆激酶的研究进展

今后20年,我国将步入老龄化社会,血栓病是中老年人的高发病,是对死亡威胁最大的疾病之一,血栓性疾病,尤其是急性心机梗塞严重威胁着人类的生命与健康.目前,溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段,当今用于临床治疗的药物包括链激酶（streptkinase简称SK）、尿激酶（Urokinase,简称UK）、组织血纤溶酶原激活剂（t-PA）、单链尿激酶型血纤溶酶原激活剂（SCUPA）、化学修饰的血纤溶酶-链激酶激活剂复合物（APSAC）等.这些药物均为激活血液中的血纤溶酶原,从而降解纤维蛋白而间接地起作用.在实际应用上,它们都是注射或滴注用药物,有可能引起病人产生全身性内出血,而且在血液中的半衰期很短（3～20 min）,因此在使用这些药物时必须长时间的滴注用药,很不方便,且来源紧缺,造价高.因此,开发新型溶血栓药物成为当前重要研究课题之一.     

第二代组织纤溶酶原激活剂

组织纤溶酶原激活剂(t-PA)被誉为本世纪最令人嘱目、最有前途的血栓溶解剂。自1983年Pennica首先在大肠杆菌中成功地克隆并表达t-PA基因以来,这种血栓溶解剂的研究一日千里,迅速成为美国及世界其他各国生物工程公司的重点研究项目。     

t-PA在哺乳动物细胞中的表达调控及高效表达

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤维蛋白有较强的亲和力,可选择性溶解血栓而不引起全身出血倾向,所以是一种较理想的溶血栓药物。美国的重组t-PA已通过FDA批准,应用于临床,每年销售达数亿美元。国内上医,北大,南大及我所先后开展了t-PA在CHO细胞中的表达的研究,经多年努力表达水平约1～2μg(200～400IU)/10~6细胞/24小时,但该水平离中试生产尚有差距。     

尿激酶原的性质、结构、功能及其药代动力学和临床应用效果

溶栓疗法不仅已被常规地用于急性心肌梗死的治疗,而且也已用于其它血栓病的治疗中,如急性缺血性脑血栓、肺栓塞、急性周围动脉血栓等。尿激酶原是双链尿激酶的单链前体,它主要激活纤维蛋白表面的纤溶蛋白原,所以具有选择性溶栓作用。临床结果表明它是一种安全有效的溶栓药物,与t-PA、链激酶或尿激酶伍用均有协同作用。本文综述它了的特性、结构与功能,以及它的药代动力学和临床的治疗效果。     

抗t-PA抗体水平和血栓的相关性研究

目的:研究自身免疫性疾病病人抗t-PA抗体水平和病人血栓形成之间的关系。方法:用酶联免疫吸附法(ELISA)检测原发性抗磷脂综合症和红斑狼疮患者(32例狼疮样抗凝物阳性,32例狼疮样抗凝物阴性)与40例健康对照的IgG类抗t-pA抗体的水平,用Pearson Chi-Square test的方法分析了病人体内IgG类抗t-PA抗体水平和血栓之间的相关性。结果:本试验研究的病人群体中IgG类抗t-PA抗体阳性的有13(20.3%)个,并且我们的研究表明IgG类抗t-PA抗体阳性和血栓病史显著相关(P=0.04)。结论:原发性抗磷脂综合症和红斑狼疮病人群体中有较高的IgG类抗t-PA抗体水平,它们可能和病人体内血栓的发生有关。     

定量检测组织型纤溶酶原激活剂夹心ELISA方法的建立

目的:建立灵敏、特异的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)定量测定方法,为血栓性疾病和肿瘤性疾病的早期诊断及疗效评估提供辅助手段。方法:采用抗t-PA多克隆抗体包被酶联板、HRP标记抗t-PA单克隆抗体为标记抗体、重组t-PA为标准品,建立定量测定t-PA的夹心ELISA双抗体法。以t-PA测定的特异性、灵敏性和重复性评价夹心ELISA测定法。结果:夹心ELISA测定法可检测t-PA浓度为0.5ng/mL的样品,不同样品的组内和组间的变异系数分别为4.7%和8.4%。采用夹心ELISA法测定40份正常人血浆,t-PA的平均含量为(4±2.1)ng/mL。结论:夹心ELISA测定法具有灵敏性高、特异性强的特点,可用于人血浆中t-PA水平的定量测定。     

Genentech向加拿大赔款1300万美元并降低t-PA价格

加拿大专利药品价格评审委员会(Canadian Patented Medicine Prices Review Board)要求Genentech赔偿1370万美元。原因是该公司的血栓溶解剂,组织血纤维蛋白溶酶原激活子(t-PA)在加拿大和在美国的价格存在差异。此外,Genentech还被要求降低t-PA在加拿大的售价,使其与在美国     

半衰期延长获得PAI－1抗性的t—PA突变体的构建、表达及特性分析

用基因重组及定位突变技术成功地构建了t·PA的Kl区缺失突变体t—PAdelKl、PAI-1结合位点缺失突变体t—PA del(296—302)及两者的组合突变体t—PA del(Kl·296—302),并在COS－7细胞中实现三者的暂时性表达,在cHO细胞中实现了t·PA deI(K1．296—302)的稳定性表达．对表达产物的生物学特性分析表明,t—PA del(296—302)及t-PA del(K1,296—302)获得了Pal－1抗性．因时t-PA del(K1．296—302)在大鼠体内的半衰期延长约5倍,而与纤维蛋白的亲和力只略有下降。因此,此组合突变体有可能成为优于野生t—PA的新型溶栓剂候选株．     

t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅱ.t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr^- ),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000IU/10~6细胞·d^-1.重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

t-PA昆虫细胞表达及特性分析

应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)cDNA。序列分析证实,与国外的报道完全一致。将含完整阅读框架的人t-PAcDNA克隆至昆虫细胞表达转移载体pBacPAK8中,获得重组质粒pBac-tPA。应用脂质体共转染法,将pBactPA和线性化杆状病毒BacPAK6DNA共转染Tn-5B-1昆虫细胞。经空斑筛选获得11株重组病毒。经PCR鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达t-PA的重组病毒BactPA3。在含胎牛血清的培养基中,t-PA表达活性在感染(MOI≈10)后72h左右达到最高,为3.04×103IU／ml,即相当于1.8×104IU／106细胞;在无血清培养基中,t-PA最高表达水平相差不大,但时间为感染后132h左右。经SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析,分子量为68kda左右。与从人黑色素瘤细胞培养液中提纯的天然t-PA相比,其受纤维蛋白原激活的特性、和纤维蛋白的亲和力及在血浆中的失活速率基本相同。表达的t-PA在血液循环中的半衰期为7min。     

蕲蛇酶溶栓和抗栓作用机理

蕲蛇酶以全面改善纤溶系统各组份功能,诱导血管内皮细胞释放t-PA,t-PA将纤维蛋白溶酶原变成纤溶酶,溶解血栓。此外,本品分解血纤维蛋白原,生成降解A肽纤维蛋白单体,从而促进t-PA激活纤维蛋白溶酶原转变成纤溶酶效应,促进溶栓。蕲蛇酶是目前唯一对各种诱导剂引起的血小板聚集都具有明显抑制作用的药物。蕲蛇酶对新鲜性、陈旧性,及各种模型动静脉血栓均具溶栓作用蕲蛇酶溶栓和抗栓作用机理     

重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测

人组织纤溶酶原激活剂(ht-PA)是临床血栓疾病治疗的主要生物药品,应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道,但重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K1区位点缺失体为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rh PA,通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔,ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只(2♂,3♀),其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂,rh PA浓度最高可达400μg/m L,表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明,重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达,表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。