光合磷酸化偶联机制的研究——高能态与光合磷酸化的关系

我们进一步研究了叶绿体照光时形成的高能态与光合磷酸化的关系。结果如下:恒态下,苯二胺等弱有机碱可大大促进高能态(Z~*)的积聚。但是在起始时间内与对照相比,Z~*的形成却被显著抑制,而对光合磷酸化(PSP)活力影响很小。这说明这时推动ATP形成的动力可由⊿H~+以外形式的高能态来提供。当叶绿体照光时,分别用可去除类囊体膜内外AH~+的解联剂NH_4Cl或可消除电位差(⊿E)的载离子体短杆菌环肽(G·D)处理,或者共同作用,Z~*的形成几平全被抑制,而PSP活力仍有少量残留。说明有AH~+、⊿E以外形式的高能态的存在,以推动ATP形成。叶绿体在预照光时加入无载体~(32)P_i,形成了Z～~(32)p。实验表明这Z～~(32)P可能是类囊体内源ATPb在光下磷酸化或ATPb与~(32)Pi交换的产物~(32)P～ATP。Z～~(32)P的形成不受NH_4Cl或G.D的抑制,即在去除AH~+或⊿E之后,~(32)P_i仍能参入CF_1上的结合态核苷酸形成ATP,说明CF_1构型变化所需的能最供给有的不是以AH~+或⊿E形式,设想有一种膜上高能态(M~*)直接参与。这M~*的性质及其在光合作用能量转化过程中的意义将有待深入研究。     

恒态光合磷酸化与△pH和△ψ的关系

在恒态下推动ATP形成的△μH~+中,除ApH外,△ψ的贡献也很明显:进行PSP反应,耗用H~+,降低了⊿pH幅度。NH_4Cl,尼日利亚菌素(Nig)对⊿pH和PSP的抑制作用是同步的。CCCP影响膜对质子的透性,加速内部质子外流,降低内部质子浓度,减少⊿pH幅度,抑制了PSP反应。PSP更依赖于类囊体内部质子浓度。在短杆菌环肽(Gram)(～5×10~(-8)mol/L)和缬氨霉素(Val)(～5×10~(-7)mol/L,+K~+)的作用下,⊿ψ几乎被完全消去,并对⊿pH无明显作用,但PSP分别被抑制了～30％(Gram)和～50％(Val),表明在恒态PSP反应中有30％～50％的能量来源可由⊿ψ提供。     

光合磷酸化偶联机制研究——氯化铵对光合磷酸化的促进作用

1～3×10~(-4)M 氯化铵在较低浓度磷酸盐时降低光合磷酸化活力增进希尔反应速度表现出解联效应,在较高浓度磷酸盐时,希尔反应速度仍加快而光合磷酸化活力也被促进。用两阶段光合磷酸化技术及测定对叶绿体萤光淬灭作用的影响表明,氯化铵在上述条件下是消除类囊体腔内的高能态的。解联剂短杆菌环肽在1×10~(-8)M 时也可表现出对光合磷酸化有促进作用。将上述浓度氯化铵和短杆菌环肽同时加入反应液对光合磷酸化仍有促进作用,甚至似乎更显著。联系过去研究光合磷酸化高能态时提出它可能有不同存在状态的推测,对上述现象作了分析和解释。     

光合磷酸化偶联机制的研究寡霉素对PSP、ATP酶和ATP_b-Pi交换反应的作用

在过去工作基础上,我们进一步研究类囊体膜上牢固结合的ATP_b 与Pi 的交换反应和PSP 的关系。主要结果是:①在线粒体中对ATP 酶复合体的疏水蛋白专一敏感的寡霉素,对叶绿体中ATP 的光下形成和水解均表现为抑制,其中对ATP 酶活力的抑制要比对ATP 形成的抑制强烈得多,对核苷酸交换和光下H~ 吸收也有明显的抑制作用(表1)。②去除内源游离核苷酸的叶绿体悬浮液,与Pi(~(31)Pi ~(32)Pi)照光(不外加ADP),发现在适当的寡霉素浓度(20微克/毫克蛋白)下显著促进此系统ATP 中~(32)Pi 参入的数量;并且在所测温度下均促进,温度升高(30℃),促进作用更为明显(表2,3)。③用荧光素酶测定ATP 的方法对上述系统的反应产物进行鉴别,并与~(32)Pi酯化法相比较,证明寡霉素促进的是ATP_b-Pi 交换(图1,2;表4,6)。④ATP_b-Pi 交换反应与类囊体膜的能量转换有密切的关系。这交换反应需光、需辅助因子,也受解联剂的影响(表5),是需能反应。这ATP_b-Pi 交换,较之PSP 受解联剂的影响要小得多,可能它与膜上高能态有更为直接的联系。     

Mg~(2 )对巯基修饰类囊体膜H~ -ATP酶的质子传导途径的调节效应

镁离子为巯基修饰类囊体还原型H~ -ATP酶光活化所必需。介质中MgCl_2浓度由2mmol/L增加到10mmol/L时,解联剂NH_4Cl对H~ -ATP酶光活化的抑制作用明显减弱,而对跨膜⊿pH的消除效应并未减轻。介质中Mg~(2 )浓度的增加不影响DCMU对H~ -ATP酶光活化的抑制作用。 介质中含40μmol/LADP时,低浓度NH_4Cl对H~ -ATP酶催化的刺激效应被消除,仅呈现抑制作用。这种NH_4Cl对H~ -ATP酶催化活性的抑制作用随着反应介质中Mg~(2 )浓度的增加而降低,因此认为Mg~(2 )参与质子传导途径的调节。     

光合磷酸化偶联机制研究——Ⅷ、6-苄氨基嘌呤对光合磷酸化的促进作用

在反应介质pH 7.2条件下,观察到6-BA处理叶绿体后,能促进循环(+PMS)和非循环(+FeCy或MV)的光合磷酸化反应,提高叶绿体的偶联程度,增加P/e_2比值。此促进现象与叶片的生理状态密切有关。在对光合磷酸化有促进作用的情况下,6-BA可改善类囊体的能化状态,增加高能态的积累。对光激活的叶绿体膜上Mg~(2+)-ATP酶和偶联因子热活化的ATP酶活力均表现出促进作用。6-BA的作用部位可能与膜上的偶联因子有关。     

光合磷酸化偶联机制研究——Ⅸ.抗生素HP-1对光合磷酸化的解联作用

抗生素HP-1在10~(-7)～10~(-6)M时可以有效地降低光合磷酸化活力,并促进电子传递。它象氯化铵一样能降低光照射时类囊体的质子吸收,但在降低光合磷酸化活力时,既不象氯化铵那样受反应液中磷酸盐浓度的影响,又不象尼日利亚菌素那样依赖反应液中K~+存在。抗生素HP-1可以作为一种新的解联剂而用于光合磷酸化及生物能量转换反应的研究。     

关于高能态在光合磷酸化中的意义——高能态形成与光合磷酸化初速之比较

在我们过去关于光合磷酸化高能中间状态的工作基础上,本文着重从反应初速方面分析高能态形成与光合磷酸化的关系。结果表明,在短时间(<1秒)照光下,高能态形成(pH6)和光合磷酸化(pH 7.8)速度是相近的;两者的光饱和点相同;对温度的反应也相同。说明此高能态可能是光合磷酸化反应途径上的直接的中间步骤。这个高能态(在10~(-4)～1秒照光下测定)与过去在较长照光时间内(1～15秒)所测定的高能态(Z*)有所不同,对二者之间的关系作了讨论。     

类囊体膜的能化状态与光合磷酸化反应活化能的关系

在0～28℃范围内测定了菠菜离体叶绿体的光合电子传递和磷酸化反应的活化能。发现叶绿体处于解联状态时,Hill反应的Arrhenius图在7～8℃处呈现出活化能改变的折点。叶绿体在光下的能化状态由于加入ADP及Pi进行磷酸化反应而消除时,活化能的折点依然在8℃附近呈现,表明活化能折点的出现与光合膜能化状态消失有关。不同光系统的电子传递和磷酸化反应的Arrhenius图表明,活化能折点的出现主要发生在与PS-Ⅱ有关的反应中,而与PS-Ⅰ反应的关系不大。     

乙醇对菠菜叶绿体的光合作用的影响

乙醇对菠菜离体叶绿体光合作用过程的许多功能有明显的影响。反应液中乙醇浓度在0.5～10％时,随乙醇浓度的增加,对电子传递,光合磷酸化,高能态形成和光下pH上升的抑制效应也增加。乙醇对高能态形成的抑制作用最为明显,并且在光阶段加入乙醇的抑制作用大于暗阶段的作用,还促进了高能态在暗中的衰变。当反应液中乙醇浓度超过了2％时,它对Mg~( )—ATP酶的活力也表现出抑制作用。乙醇是通过影响叶绿体类囊体膜而起作用的。     

金霉素促进光合磷酸化机理的再探

在叶绿体经TPCK—trypsin光下修饰后,电子传递加速、磷酸化解联、膜上偶联因子Mg~(2+)—ATP酶活力促进的条件下,用金霉素处理叶绿体,能降低TPCK—trypsin 对磷酸化的解联程度,部分降低膜上Mg~(2+)—ATP酶的激活。在NEM及TPCK—trypsin共同存在时,金霉素处理仍能部分恢复磷酸化活力。进一步证明了金霉素是作用在偶联因子上的γ亚单位或其邻近部位,使之减少能量耗散而提高磷酸化活力.     

光合磷酸化偶联机制研究——Ⅱ.金霉素对光合磷酸化促进作用的研究

用金霉素溶液处理菠菜离体叶绿体,对循环( PMS)和非循环光合磷酸化( FeCy、MV或BQ DBMIB)均可表现出促进作用,表明它对两个能量保存部位都有促进作用。它能提高磷酸化的偶联程度,增加ADP/O及PC比值。在对光合磷酸化有促进作用的情况下,用两阶段光合磷酸化法测定,它对高能态的积累略有增加或影响不大,但它能显著增加叶绿体的延迟发光。它对叶绿体膜上Mg~(2 )-ATP_(ase)及偶联因子Ca~(2 )-ATP_(ase)活力有抑制。金霉素溶液的荧光强度可被加入偶联因子所提高,这些都表明金霉素至少有一个作用部位与偶联因子有关。文中对它能促进光合磷酸化作用的机理进行了讨论。     

光合磷酸化的研究 Ⅷ.黄化小麦幼苗变綠时光合磷酸化活力的发生

(1)黄化小麦幼苗初变绿时,光合磷酸化活力之发生远较叶绿素的生成为迟。在实验条件下,照光变绿3小时后,才可测得光合磷酸化活力,且其按叶绿素为基础计算的活力随照光变绿时间的增加而增加,至照光变绿7—8小时后,叶绿体上叶绿素含量尚在继续增加,但光合磷酸化活力则趋向恒定。(2)在黄化幼苗变绿初期,测得的循环光合磷酸化ATP形成能力较非循环光合磷酸化ATP形成能力高得多,以后较接近;但将循环光合磷酸化之ATP形成能力与非循环光合磷酸化之放氧能力相比较,则其比例在不同时期相差不大。这说明,在变绿初期非循环光合磷酸化之ATP形成能力特别小的原因,主要是由于当时它的偶联程度特别低,并不是因为它较循环光合磷酸化多牵涉到放氧等步骤,而这些步骤可能发生得较晚所致。以DCPIPH_2作氢供体的氧化光合磷酸化活力的最初增长情况与以Fe(CN)_6~≡作氢受体的非循环光合磷酸化ATP形成能力的增长情况一样,均比以PMS促进的循环光合磷酸化活力增长时间为晚,这结果也有助于证明非循环光合磷酸化ATP形成能力增长较晚的原因与它牵涉到放氧步骤无关。(3)使黄化变绿幼苗光合磷酸化、希尔反应活力达到饱和所需的光强度与绿苗所需的相仿。变绿初期的叶绿体,其光合磷酸化作用有很强的“光强效应”,卽弱光下电子传递速度慢、PSP活力低时,与磷酸化的偶联程度会急剧下降。这现象可能是造成变绿初期测得的非循环光合磷酸化ATP形成能力特别低的原因。(4)黄化幼苗变绿时,同化CO_2能力之发生时间与光合磷酸化活力之发生时间差别不大,但以叶绿素为基础计算,前者的活力较早达到恒定。     

寡霉素对叶绿体质子传导的作用

在叶绿体中,寡霉素具有加速类囊体内部质子(H~ in)流出的作用,相应地加速光合磷酸化高能态的暗衰变;寡霉素完全不能恢复叶绿体残缺膜在光下形成膜内外质子浓度梯度的作用,它对H~ in流出的加速,不是由于对类囊体膜透性的影响,而是影响于ATP酶复合体的质子传导。由于这种加速作用,导致类囊体在光下形成的膜内外质子浓度梯度的降低,从而抑制了光合磷酸化活力。 可溶性的CF_1经用DTT或胰蛋白酶活化后所表现出的Ca~( )ATP酶活力对寡霉素敏感不同,DTT活化者受寡霉素的抑制,而胰蛋白酶活化者则不敏感。说明它的作用部位是在CF_1上而不在CF_0上,而且可能与胰蛋白酶活化时切去的多肽有关。 寡霉素对电子传递有一抑制作用部位,但其作用较轻微。     

三苯基锡,二环己基碳二亚胺和寡霉素对叶绿体CF0与CF1功能联系的影响

作用于H~ —ATP酶复合体质子通道的能量传递抑制剂 TPT、DQCD和 OM能明显抑制叶绿体光合磷酸化反应和膜上 ATP酶活性,减小恒态ΛpH值,加速ΛpH和515 nm吸收衰减。这种在正常叶绿体加速H_(in)~ 经CF_0外流与在残缺膜中阻塞质子外流不一致。TPT等物质是干扰了CF_0与CF_1的构象连接,使 CF_0的质子传导失去CF_1的控制,H_(in)~ 无效漏失或质子逆向转移受影响,从而抑制与质子传导紧密相关的光合磷酸化反应和膜上ATP酶活性。     

光合磷酸化偶联机制的研究——Ⅲ.胺对光合磷酸化的促进作用

进一步研究比较了氯化铵和一些胺对光合磷酸化的影响。发现甲基胺等在低浓度(2×10~(-4)M)时,对光合磷酸化的影响与氯化铵相似,但它对磷酸盐的浓度要求较氯化铵低。用pH电极法测得氯化铵和甲基胺在促进光合磷酸化的浓度下时,能降低类囊体的质子吸收。2×10~(-4)M的氯化铵和甲基胺在高浓度磷酸盐存在时,也能促进闪光下的光合磷酸化,但对叶绿体的延迟发光无明显影响。     

光合磷酸化的研究 Ⅳ.Mehler反应与光合磷酸化

我們同时測定了小麦离体叶綠体的Mehler反应与光合磷酸化作用,結果指出: 1.光合磷酸化輔助因素Vit.K及FMN促进Mehler反应,PMS无影响。2.离体叶綠体不加輔助因素或加入Vit.K或FMN的情况下,ATP与CH_3CHO的形成量有一定的数量关系。由此算出的P/O值約为同时測定的K_3Fe(CN)_6系統的P/O值的二倍。在偶联得完全的制剂中,P/O值达2。3.无論对电子传递还是磷酸化作用,pH、解联剂(NH_4~ )及叶綠体保存时間对Vit.K及K_3Fe(CN)_6系統的影响均有一致的趋势。4.在有氧条件下,P/O值与輔助因素的浓度无关。本文結果指出了Mehler反应与FMN或Vit.K导致的光合磷酸化实际上发生在同一个过程中,这样就进一步肯定了Vit.K与FMN导致的光合磷酸化都是属于非循环方式。对它們在生理上的可能作用也作了簡短的討論。     

水分胁迫对甘薯叶肉细胞光合电子传递的影响

水分胁迫降低了甘薯叶肉细胞的光合能力。在有解偶联剂存在时,水分胁迫对叶肉细胞的光合电子传递没有影响,但在无解偶联剂存在下,水分胁迫促进了甘薯叶肉细胞的光合电子传递,表现出明显的解偶联效应。水分胁迫伤害了甘薯叶绿体偶联因子结构,使ATP合成受阻,叶肉细胞的光合滞后期加长。     

光合磷酸化的量子需要量

用菠菜叶绿体悬浮液,在红光下(620—660mμ,6—8×10~3尔格/厘米~2-秒)测定同位素P~(32)标记的无机磷酸进入ATP的强度,并根据吸收的光能量换算为形成一个分子ATP所需要的红光量子数。结果指出: (1)循环光合磷酸化作用,不论用何种辅助因素(PMS,维生素K_3,FMN),形成一个分子ATP的量子需要量均在4—5之间(最低一次获得2.9)。叶提取液代替辅助因素,结果亦同。(2)与希尔反应偶联的光合磷酸化作用(希尔氧化剂为K_3Fe(CN)_6或TPN)的量子需要量亦是4—6。同时测定的还原作用指出希尔反应中每放出一个分子O_2,需要8—12个红光量子,表示在试验条件下,二者是完全偶联的(P/2e?1)。没有磷酸化(不加ADP及P_i)时,希尔反应的量子需要量不变,表示偶联的ATP形成不需额外的光量子。(3)光强度减低,则循环与非循环光合磷酸化作用的效率随之降低,量子需要量增加,而希尔反应的效率则不变。从上述结果推论,两种光合磷酸化作用均是通过同一的电子传递系统,在此系统中仅有一个磷酸化部位,除非另有一个部位是极易破坏的。试验结果也对光合作用的量子需要量问题,供给可能的解释。在弱光下光合作用效率高,可能是由于部份ATP来自呼吸;而在强光下效率减低,则是呼吸所供给的ATP不足而必需依靠循环光合磷酸化所致。     

多粘菌素B对光合磷酸化的促进作用

多粘菌素B在低浓度的磷酸盐存在下,抑制光合磷酸化和电子传递,但在较高浓度的磷酸盐存在下,却能促进光合磷酸化和提高P/O值。多粘菌素B在促进光合磷酸化时与无机磷酸之间存在着类似竞争的关系,并显示出能增加叶绿体的毫秒延迟发光和用中性红表示的类囊体膜内外的pH变化,多粘菌素B亦能促进光下的ATP_P_j交换。根据上述实验结果;我们推测多粘菌素B在类囊体膜上可能有两个作用部位,一个在类囊体膜上,另一个在偶联因子(CF_1)的β亚单位上。