蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。     

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。     

重组人干扰素βser17工程菌发酵培养条件的优化研究

实验对重组人干扰素βser17(rhIFNβser17)工程菌的发酵培养条件进行了研究,通过实验优化确定了适宜rhIFNβser17表达的培养基、诱导剂使用浓度、诱导时期和诱导后的收获时间等,建立了发酵培养工艺,并在50L发酵罐进行了中试发酵,菌体收获量湿重达13.08g/L,rhIFNβser17表达量占菌体总蛋白的20.2%,纯化后比活性达2×107IU/mg蛋白以上,为进一步的下游开发奠定了基础。     

弧菌外膜蛋白ompk工程菌规模化培养表达初探

目的:为Ompk亚单位疫苗生产提供参数。方法:利用振荡和发酵培养,测定不同培养时间的菌液浊度和蛋白诱导表达效果。结果:工程菌30℃摇瓶培养10h,种子罐培养8～10h,较为合适;摇瓶和5L发酵罐诱导表达培养,升温42℃诱导表达,7h效果较佳;经5批次50L、500L发酵罐诱导表达培养,均可得到重组蛋白表达的工程菌体,50L和500L发酵罐最高生物量分别为5.32g/L和6.38g/L,平均可达到3.75 g/L和4.74 g/L;适当延迟升温诱导前的培养时间,可提高工程菌的得率。结论:初步确定了重组蛋白工程菌规模化诱导表达培养方法,利用500L发酵罐培养可得到诱导表达的工程菌体。     

重组人白细胞介素-11工程菌的发酵条件研究

为了探讨发酵条件对大肠杆菌表达人白细胞介素-11融合蛋白的影响,利用正交实验设计,对工程菌的生长条件和人白细胞介素-11融合蛋白表达进行优化。在摇瓶中研究了培养基中的葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物的浓度、pH及摇床转速、装液量、接种量等。确定了工程菌生长及表达的培养基和培养条件:葡萄糖10g/L,蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,pH7.5,接种量10%,装液量10%,摇床转速220r/min及诱导时间为4~5h。然后在BiofloⅢ-5L发酵罐中以优化的发酵条件进行了3批实验,结果表明:工程菌量达到55g/L(DCW),重组人白细胞介素-11融合蛋白表达量为33%左右,为进行中试研究奠定了理论基础。     

50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌

中试规模发酵重组人核苷二磷酸激酶A（rhNDPK-A）工程菌,并对表达产物进行纯化。摇瓶培养一级种子至合适密度,以10%比例接种二级种子培养基,在7L发酵罐中培养至OD600为9.6～10.5,然后转入80L发酵罐中进行补料分批培养,所得菌体裂解后,经离子交换层析和亲和层析两步纯化得重组蛋白制品。结果表明,50L培养液经过10h培养后,湿菌收量为1560 g/批,NDPK-A表达量为23.8%。另外,补料方式对发酵密度有明显影响。与单纯补加碳源相比,同时补加碳源和氮源可以显著提高菌体产量,但对目的蛋白表达量地提高不明显。在较优条件下,菌体产量为(2220.00±169.71) g/批,蛋白表达量为(22.00±0.42) %,纯化后重组蛋白得率为510mg/L。产物可溶、密度适中、工艺简便的中试发酵条件的建立为高得率、大规模制备重组rhNDPK-A奠定了基础。     

重组胸腺素α1的表达、纯化和生物学活性

为获得重组人胸腺素α1(recombinantthymosinα1,Tα1) ,采用融合表达方式表达Tα1基因 ,重组融合表达载体Tα1 pGEX 4XT 1转化大肠杆菌DE3(lys)构建工程菌 .对工程菌进行补料分批培养并诱导表达 ,得到目的蛋白的可溶性表达 .亲和层析纯化融合蛋白GST Tα1,经凝血酶裂解融合蛋白 ,亲和层析除去GST ,SourceQ离子交换 ,得到Tα1单体 ,得率为 30mg L发酵液 .生物学活性分析显示 ,重组Tα1能显著促进小鼠脾细胞增殖 (P <0 0 1) ,其活性与天然Tα1相似     

重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化

旨在优化重组人抗血栓蛋白(rHAP)工程菌的自诱导培养基,以提高菌体产量及可溶性的重组rHAP蛋白含量.选取蛋白胨、酵母提取物、甘油、葡萄糖为因素,各取4个水平,采用正交表L16(45)进行试验设计,时影响菌体生长和可溶性rHAP表达水平的乳糖浓度进行了优化.结果表明自诱导培养基碳氮源的最优配比:2％蛋白胨,1.5％酵母,0.5％甘油,0.03％葡萄糖,0.2％乳糖.此时表达菌密度OD600和可溶性rHAP目标蛋白表达量分别是未优化前的2.04倍和2.85倍.在20 L发酵表达时,rHAP工程菌OD600值高迭93,菌体温量为1 620 g/20L.利用Q-Sepharose和SP-Sepharose纯化,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白.     

重组尿酸氧化酶发酵工艺优化

目的:优化并获得重组尿酸氧化酶(rUOX)基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-32a-uox高密度发酵的工艺参数。方法:在三角摇瓶中进行培养条件的优化实验,分别考察了pH值、接种量、无机盐、碳源、诱导强度等对工程菌生长和重组蛋白表达的影响,得到了优化的发酵条件;在此基础上放大至NBS BIOFLO 110 14 L发酵罐,通过对诱导时机的优化,利用分批补料发酵的方式,使rUOX在高密度培养的条件下得到高表达。结果:在优化的发酵条件下,菌体密度(D600nm)最终达到50以上,相当于20 g/L干重;可溶性rUOX占菌体总蛋白量的45%,其含量达到3.45 g/L。结论:为规模化制备重组黄曲霉尿酸氧化酶奠定了基础。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的表达、纯化与初步鉴定

目的构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并对融合蛋白进行纯化。方法利用逆转录-PCR获得乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(Polymerase)反式调节人类新基因HBVD-NAPTP1,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌进行诱导,并利用组氨酸亲和层析方法对融合蛋白进行纯化。结果 HBVDNAPTP1原核表达载体转化宿主菌后,经0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h获得了分子量约为31 kD的HBVDNAPTP1融合蛋白的优化表达,Western blotting证实融合蛋白的特异性。亲和层析纯化后得到较纯的HBVDNAPTP1融合蛋白,每升培养菌液中可获得2.24 mg的纯化蛋白。结论成功获得纯化的HBVDNAPTP1融合蛋白,为今后开展HBVDNAPTP1的生物学功能研究奠定了物质基础。     

重组类胰岛素样生长因子-Ⅰ的纯化与复性

目的 获得高纯度和高活性的胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor, IGF-1）;方法 构建好的BL21大肠杆菌工程菌经IPTG诱导,以融合一段截短型半乳糖苷酶及His-tag形式表达IGF-1融合蛋白(约15,000Da),超声破碎,提取包涵体经镍柱亲和层析后, 用羟氨切割纯化的融合蛋白,纯化后的蛋白质在小分子保护剂及GSH/GSSG的存在下复性。结果 经Ni2＋柱亲和层析, IGF-1纯度达90％以上,复性后得到有较高生物活性的IGF-1。结论 IGF-1发酵及纯化和复性方法的建立为大量生产IGF-1打下了基础。     

High-level expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for [Leu-28]echistatin

A gene (Ecs) encoding a platelet aggregation inhibitor, echistatin (Ecs), has been chemically synthesized. Met at position 28 of the native protein was replaced by Leu in the recombinant Ecs. To express this synthetic gene in Escherichia coli, an expression vector, pJC264, was constructed by inserting portions of the E. coli cheB and cheY gene complex into the plasmid pUC13. High-level expression of the synthetic [Leu-28]Ecs was achieved by its fusion with the E. coli cheY gene in the expression vector. Recombinant [Leu-28]Ecs was liberated from the fusion protein by CNBr cleavage at the Met inserted between the CheY protein and [Leu-28]Ecs. The recombinant [Leu-28]Ecs was purified to homogeneity by reverse-phase high-performance liquid chromatography. The refolded [Leu-28]Ecs was identical to native Ecs in inhibiting platelet aggregation, suggesting that Met at position 28 is not essential for the biological activity of this platelet aggregation inhibitor.     

重组FAS分子的表达、纯化及抗体制备

用ＰＣＲ法扩增出编码人ＦＡＳ分子胞外区的ｃＤＮＡ片段,直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经ＤＮＡ序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－ＫＧ的ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ位点之间,构成重组质粒ｐＫＧ－ｈＦＡＳ,将此质粒导入大肠杆菌,经ＩＰＴＧ诱导后获得ＧＳＴ－ｈＦＡＳ重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ经亲合层析获得纯化的ＧＳＴ－ｈＦＡＳ蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除ＧＳＴ部分,得到纯化的ＦＡＳ蛋白．用纯化的ＦＡＳ抗原免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体,经检测发现抗ＦＡＳ抗体能诱导Ｕ９３７细胞发生细胞凋亡     

肾炎致病原重组受体相关蛋白的表达及纯化

用pGEX载体系统体外构建了Heymann肾炎致病原受体相关蛋白(RAP)重组表达质粒,经IPTG诱导,该质粒表达的融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量达39．4％,经GST-Sephrose 4B亲和层析,得到了高度纯化,其诱导产生的抗体经蛋白质印迹法分析证明能识别肾皮质天然抗原44ku受体相关蛋白.RAP表达及纯化的成功为研究致病原病理性表型提供了有利条件．     

死亡肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将人工合成的寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到死亡肽（thanatin）基因,并将其克隆到表达载体pGEX-3X中,序列分析结果正确。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行高效可溶性表达,表达量可达20%以上。融合蛋白通过GST亲和层析纯化,用肠激酶酶解表达产物,用Sephadex G-25初步纯化得到具有抗菌活性的死亡肽。     

人血管生成素-PE40融合蛋白基因的构建、表达及活性研究

利用 PCR扩增出人血管生成素 (h ANG)成熟肽的基因片段 .与绿脓杆菌外毒素缺失突变体PE40的基因连接后 ,克隆入 p UC1 9载体中 .测序后克隆入表达载体 p RSETB,构建成 h ANG-PE40融合基因的表达载体 .IPTG诱导 ,表达出分子量约为 58k D的 His6- ANG- PE40融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 8% .Ni2 +- NTA树脂纯化表达蛋白 ,SDS- PAGE结果显示纯化重组蛋白为单一条带 .鸡胚绒毛尿囊膜鉴定表明重组蛋白体外能够有效地抑制血管的形成 .     

重组人肝刺激物在原核细胞中的表达与纯化

利用基因重组技术 ,构建成人肝刺激因子 (hHSS)和谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL 2 1(DE3 ) ,以His·Tag亲和层析纯化表达产物 ,FactorXa切割分离hHSS单体 ,并检测其生物学活性。结果显示 ,在pET 4 2a表达体系中hHSS以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在 ,GST hHSS表达量占菌体可溶性蛋白的3 0 % ;FactorXa切割GST与hHSS之间肽腱 ,得到 3 3和 15kD两条蛋白带 ,经Western杂交证实 3 3kD条带为GST ,而 15kD条带的分子量与hHSS基因序列推测蛋白结果相符。经His·Tag再次纯化可获得hHSS单体 ,初步证实重组hHSS具有促进肝癌细胞增殖活性     

迟眼蕈蚊抗菌肽BhSGAMP-1-S在大肠杆菌中的优化表达及其活性分析(英文)

【目的】BhSGAMP-1 是迟眼蕈蚊唾液腺抗菌肽,为了能够更好的了解其分子特性,我们将其表达、纯化并进行了活性测定。【方法】依据大肠杆菌稀有密码子设计并合成了抗菌肽基因 BhSGAMP-1-S,以 pMAL-c2X 作为表达载体在大肠杆菌 TB1 中进行融合表达,融合蛋白通过麦芽糖亲和层析柱进行纯化,获得的融合蛋白经肠激酶切割后,混合物通过分子筛凝胶层析和反相高效液相色谱来获得单体重组抗菌肽 BhSGAMP-1-S,对获得的抗菌肽进行活性测定。【结果】在最优的表达条件下融合蛋白以可溶的形式表达,100 mL 诱导菌液经多步纯化后可得 0. 38 mg 的重组抗菌肽 BhSGAMP-1-S,抑菌活性测定表明所获得的抗菌肽对部分测试革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌有较强的抑菌活性。【结论】本研究第一次成功的在大肠杆菌中诱导表达了修饰合成的抗菌肽 BhSGAMP-1-S,纯化后的抗菌肽具有很好的抑菌活性,这为进一步研究和应用奠定了基础。