羽衣甘蓝小孢子胚胎发生观察及再生植株倍性鉴定

以5个不同基因型羽衣甘蓝品种为试材进行游离小孢子培养,研究小孢子发育时期与花蕾形态的关系、基因型对小孢子出胚率的影响、胚成苗及再生植株加倍和倍性鉴定。结果表明:(1)适宜于羽衣甘蓝游离小孢子培养的花蕾形态指标为:蕾长3.5～4.5mm、花瓣/花药为0.85～1.10。(2)在5个供试品种中,‘4105’出胚率最高,每蕾2.45个,其次是‘7341’,每蕾2.18个,‘7340’和‘7348’小孢子出胚情况较差,分别为每蕾1.36和0.51个,而‘7342’没有出胚。(3)采用150mg.L-1秋水仙碱浸泡幼苗根部24h,结合流式细胞仪快速检测植株倍性,发现二倍体总加倍率为78.4%,大大提高了小孢子再生植株的利用效率。     

外源生长素对烟草(Nicotiana tabacum L.)小孢子早期胚胎发生的影响

烟草（Nicotlana tabacum L．）小孢子胚胎发生系统,不仅可以提供大量可供处理的小孢子胚,还由于小孢子胚胎发生的不同步性,可同时提供从2-3细胞原胚到分化胚一系列胚胎以供研究。利用这一便利系统,探讨了外源生长素处理对小孢子胚胎发育的影响。使用3种浓度的IAA：1、3、10μmol／L,分别对不同发育时期烟草小孢子胚进行了处理,结果发现,对不同发育时期的小孢子胚,生长素处理的效果明显不同。外源生长素对胚胎发生有促进作用,表现为2-3细胞比例与非处理组相比升高,而当小孢子发育到小球形胚后,加入外源生长素对小孢子胚的进一步发育却表现出明显抑制作用。这说明在小孢子胚胎发育过程中早期和晚期发育对生长素的需求是不同的,且对生长素的敏感程度亦不同。反映了生长素调控机制在两个不同发育时期的差异。     

甘蓝型油菜正季与反季材料小孢子的培养

本文以甘蓝型油菜Westar的F1代为供试材料,通过对8个正季和同样的8个反季材料进行小孢子培养对比实验。结果表明,相同材料(基因型)正季能获得胚状体的反季一样能获得胚状体,但是相同材料的出胚数反季要比正季少50%,并且出胚时间要晚5～8d。正季与反季材料的成苗百分率相同,平均达到93%,加倍率基本一样,达到80%。由此可见,用反季节材料培养小孢子同样能获得成功,对特殊材料可以利用此法进一步加速育种进程。     

大白菜与结球甘蓝异源三倍体小孢子植株的获得与鉴定

以6个不同基因型的大白菜四倍体(AAAA,2n=4x=40)品系9401、9402、9403、9404、9405、9406为母本,结球甘蓝二倍体(CC,2n=2x=18)自交系9501为父本配制杂交组合得到的6个杂种一代为试材,进行了游离小孢子培养研究,成功诱导出胚状体,获得了再生植株,并对部分再生株进行了染色体数鉴定和性状调查。结果表明:不同组合小孢子胚胎发生能力不同,各组合产胚率均较低;小孢子再生植株中,染色体数为18的个体所占比例最大,达46.7%;小孢子植株减数分裂行为复杂,终变期除二价体和单价体外,还有三价体等联会形式;小孢子植株性状表现各异。     

黄瓜花器形态发生、小孢子发育与花药培养

孢子发育时期与花蕾形态特征、花药颜色具有相关性。本试验目的是确定黄瓜花药的最佳培养时期,并确定对应的选蕾标准。对基因型、预处理等花药培养主要影响因素研究结果表明：不同基因型小孢子单核中后期花蕾长度不同,形态上没有差异;同一基因型的小孢子发育不同时期的花器特征和诱导率均有差异,单核中后期花药诱导率最高;低温预处理有利于保持小孢子的活力;花药培养中以黑暗中4℃、48～72h低温预处理最有助于愈伤发生。实验结果表明,黄瓜花药培养中小孢子最佳培养时期为单核中后期,取蕾标准为：花蕾长度0．90～1．50cm,绿色,瓣尖未张开,花药白绿色或淡绿色。     

用激光微束穿刺法转化甘蓝型油菜小孢子的研究

建立了油菜小孢子再生胚状体的实验体系,掌握了受体最佳发育时期,使再生频率高达２１．２个胚状体／花蕾。以油菜游离小孢子为受体,用微束激光穿刺法导入芜菁花叶病毒外壳蛋白基因（ＴｕＭＶ）,成功地获得了转基因植株。研究结果表明,用预培养３天的小孢子进行转化得到的１５个胚状体,再生出一株绿苗,２株白苗。而未经预培养的小孢子未能得到转基因植株。用植物总ＤＮＡ以ＰＣＲ法扩增ＴｕＭＶ基因产物片断,然后进行电泳检测,证明该绿苗带有芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。     

大麦雄核发育的基因型效应及相关的RAPD标记

以具有不同花粉胚胎发生能力的两个大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）基因型为材料,对离体培养花药中不同类型小孢子频率的边续统计表明,两基因型的早期雄核发育过程无明显区别,最终出愈率（平均每个花药产生的愈伤组织块数）的显著差异是在小孢子形成多核花粉以后产生的。推测基因型之间胚胎发生能力的差异不受小孢子脱分化启动能力控制,而是由其多核花粉发育成愈伤组织的能力决定的,可能与细胞壁的形成有关。利用     

甘蓝型油菜和白菜型油菜种间杂种的小孢子培养

利用分离小孢子培养从甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）和白菜型油菜（Ｂ． ｃａｍ ｐｅｓｔｒｉｓ）种间杂种中获得了胚和再生植株。所用的培养程序是,将甘蓝型油菜和白菜型油菜杂种小孢子在蔗糖浓度为１７％ 、ＢＡ 为０．１ ｍ ｇ／Ｌ的液体ＮＬＮ 培养基中３２ ℃下暗培养４８ ｈ,再转入蔗糖浓度为１０％ 的ＮＬＮ 培养液中２５ ℃下暗培养３ 周。不同杂种间小孢子胚胎发生能力存在差异,其中ＵＭ９２１（白菜型油菜）×９１１１８６（甘蓝型油菜）正反交杂种的胚产量显著高于供试的其它组合。供体植株种植在１０ ℃／５ ℃（昼／夜）条件下能显著改善杂种小孢子胚产量和质量。杂种小孢子胚产量和杂种植株每荚种子数存在极显著正相关,但杂种植株的花粉育性和胚产量间相关不显著。大多数甘蓝型油菜和白菜型油菜杂种小孢子胚衍生植株为非整倍体,２２．８％ 的植株起源于具亲本染色体数的小孢子,几乎全部为ｎ＝ １９ 的类型。讨论了影响种间杂种小孢子胚胎发生的因素以及种间杂种小孢子培养技术的可能用途     

甘蓝和青花菜杂种小孢子培养

对甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitata)×青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)的20个杂种及相应的父母本进行游离小孢子培养,并对影响甘青杂种小孢子胚胎发生的主要因子进行探讨,适于小孢子培养的培养基为1/2NLN,附加0.5mgL-1NAA、0.05mgL-1BA、5mgL-1AgNO3、0.2mgL-12,4-D和0.1mgL-1活性炭。结果有14个杂种能产生胚状体,诱导率70%;不同杂种间小孢子胚胎发生频率存在很大差异,最高的是绿洲808×夏宝,平均每蕾16.2个胚。诱导杂种胚状体发生的最佳时期是小孢子单核靠边期至双核期,34℃热激2d有利于小孢子细胞对称分裂。在含糖170gL-1的液体培养基中培养3d,添加低糖(含糖110gL-1)的培养液,可显著提高出胚率。     

辣椒花药培养胚状体发生的组织学和细胞学研究

采用荧光显微镜、扫描电镜和透射电镜技术．系统研究了辣椒花药培养胚状体发生的组织学和细胞学变化特征。辣椒单个花药中花粉发育具有强烈的不同步性。随着培养时期的变化．不同时期花粉的百分率也发生变化。处于单核靠边期的小孢子培养以后按两种发育途径之一进行发育。在多数情况下,孢子体不对称分裂,产生典型双核花粉。胚性花粉粒是由营养核的重复分裂形成的。当小孢子从四分体中释放出来．特殊类型的外壁已经形成。在随后的花粉发育过程中．小孢子体积增大,外壁继续加厚。培养24h后,小孢子体积增大。胚性发生的小孢子表现出两种不同的形态变化。当胚状体发育到心形胚时．胚状体的表皮细胞排列规则。用光学和电子显微镜分析了小孢子胚状体形态形成过程．及胚状体诱导后细胞组织发生的一系列结构变化的时序性特征,这些变化主要影响质体、液泡室、细胞壁和细胞核,进一步分化的程序模拟合子胚的发育。     

辣椒游离小孢子细胞团培养的胚状体形成

从预培养15天后的花药中机械游离小孢子及其细胞团,经28℃液体悬浮暗培养．30天后,获得了自球形期胚到子叶期胚发育程度不等的各类胚状体。从12个花药中可以形成高达22个胚状体,且子叶期胚的比例约为23％。显微镜检表明,这些胚状体来自游离的小孢子细胞．经核的对称分裂形成多核细胞或者早期形成多细胞团,最后经细胞的分裂分化形成。胚状体体表具毛,活力有差异。在适当培养基上,具活力的鱼雷期及子叶期胚状体均能发育成正常植株。7℃、32℃、35℃8天的胁迫处理均能诱导小孢子胚状体发生。但花药培养中7℃、35℃处理下的出胚率较32℃下高,而游离小孢子细胞团培养中以35℃、32℃下较好。7℃处理下获得的胚状体数很少．对产生这种现象的原因进行了探讨。出胚率在基因型间,不同胁迫处理温度间表现明显差异。而在温度处理的不同天数间差异不明显。流式细胞仪对再生株真叶的DNA含量分析表明．获得的再生株中具有单倍体、双单倍体以及单倍一双倍嵌合体植株。本结果为进一步开展辣椒雄性生殖途径的胚状体发育研究。提高辣椒成熟胚状体的频率提供了实验体系。     

影响水稻幼穗培养体细胞胚胎发生因素的研究

用水稻幼穗为外植体进行组织培养,研究了影响其体细胞胚胎发生的有关因素,建立了高频率体细胞胚胎发生的培养程序。结果表明不同基因型之间体细胞胚胎发生率的差异达到61．2％;生长素2,4－D对诱导水稻体细胞胚起重要的调控作用,细胞分裂素BA有一定的协同促进作用。干燥处理可提高愈伤组织体细胞胚胎发生率,愈伤组织含水量在60％～80％范围的培养效果较好;外源DNA溶液浸泡发育早期的心状体细胞胚．其进一步发育时异常胚的频率显著增加．成苗率降低。     

甘蓝型油菜游离小孢子培养的胚胎发生

以生长在非控温控光下的４个冬性甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）品种为供体,进行游离小孢子培养。研究发现,多数品种在开花３－７天取材最为适宜。在甘蓝型油菜小孢子培养中只有单核晚期的小孢子才可能发育成胚状体,而花药培养时处于单核早期的小孢子易于发育成胚状体。在适当花期选取发育比较一致的单核晚期小孢子培养,经数小时后,部分小孢子便开始膨大,这是小孢子发育成胚的最早标志,膨大的小孢子中,有部分形成多细胞球并进一步发育成胚。用春性甘蓝型油菜为材料进行蔗糖浓度的实验结果表明：培养３天后,在１６％蔗糖培养基中存活的小孢子最多,达１６．１３％;培养３０天后,胚状体诱导频率则以１３％蔗糖浓度为最高,每花蕾可达１４４个胚状体。如果在１６％蔗糖培养基中培养３天后,添加等体积的１３％蔗糖培养基,能够大大提高胚状体的诱导频率,为仅用１３％蔗糖培养基培养的３．７倍。这一实验体系正在用于抗菌核病的诱变与筛选,并作为外源基因导入的实验体系。     

大麦不同基因型游离小孢子的直接培养再生及培养体系的优化

以微搅拌法建立了小孢子直接游离的预处理和培养程序。在大田生长的４个对培养反应不同的大麦基因型上,以新鲜幼穗游离小孢子进行直接培养,均成功地诱导了胚状体并获得再生绿色植株。小孢子的发育进程说明,直接游离的小泡子在预处理过程中的发育要慢于在花药中预处理的小孢子,而且其培养效率也较低。直接游离小孢子的培养密度以０．８～１．０×１０５／ｍｌ较理想,至少应不低于６×１０４／ｍｌ．８％－１０％的糖浓度可明显提高小孢子分裂频率和胚状体诱导频率。实验结果也表明两种培养基ＦＨＧ和ＭＮ６无明显差异,均适宜于直接游离的小孢子培养,并对游离小孢子直接培养在理论和应用上的意义进行了讨论     

结球甘蓝和青花菜小孢子胚植株再生

结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）和青花菜（Brassica oleracea var.italica）小孢子胚再生植株频率低是目前影响游离小孢子培养技术有效应用的关键问题之一,研究其小孢子胚植株再生频率的影响因素,提高胚再生植株频率,对促进游离小孢子培养技术在甘蓝类蔬菜育种中更好地应用具有重要意义。该文以结球甘蓝中甘11和青花菜TI-111等基因型为试材,对影响游离小孢子胚再生成植株的固体培养基类型、琼脂浓度、胚的类型及胚在液体培养基中的滞留时间等因素进行了研究。结果表明：游离小孢子培养25天的子叶胚在琼脂浓度为1%–1.25%的B5培养基上植株再生频率最高。进一步通过8个不同基因型对上述实验结果进行了验证,结果显示,游离小孢子培养25天的子叶胚在1%琼脂浓度的B5培养基上植株再生频率达77.8%–97.2%。     

不同萝卜品种游离小孢子的诱导及培养体系优化研究

以19个萝卜品种为试验材料,研究各种因素对萝卜游离小孢子培养的影响.结果表明:(1)13个品种可诱导出胚状体,诱导率达到68.4%,但不同品种间产胚量存在较大差异,其中路路通翠雪产胚量可达每蕾10个,而圆白萝卜的产胚量最小为每蕾0.125个,进一步培养有8个品种得到再生植株;(2)在NLN-13液体培养基中添加活性炭和6-BA对萝卜游离小孢子出胚有较好的促进作用,小孢子分离30d后将胚状体转移至固体MS培养基上,子叶型胚可获得大量的再生植株,而畸形胚状体转移后不能获得正常的再生植株.     

初始培养条件对定兴芥小孢子胚胎发生的影响

本文探索了油菜花药培养中小孢子胚早期发育的适宜条件。花药分步悬浮法第一培养基的简化实验表明,小孢子胚在仅含有20%蔗糖的空白培养基上的诱导率(212%)与对照的(202%)无显著差异。这样,第一培养基便从原Keller培养基简化为不含大量、微量和有机元素而仅含有20%蔗糖的水溶液,并且,花药第一阶段的培养时间从原来的3—5天减少到1.5—2天。此外,研究了花药在蔗糖水溶液上的滞留时间对小孢子胚胎早期发育的影响。滞留36～48小时,小孢子胚的诱导率(135%)最佳。考察小孢子胚胎早期发育的状况与不同滞留时间的关系则发现,36—48小时内每100个活细胞里,膨大细胞约占70%。这表明,早期培养时,花粉只要膨大而不需分裂即可转入第二阶段培养,便可获得较高产率的胚状体。     

电子束辐照诱变烟草材料的小孢子培养研究

本研究以自有亲本材料B0与地方品种泉烟、柳烟杂交后与云85、红花大金元组配的三交材料为试材,用辐照剂量为100 Gy的电子束对其进行辐照处理,对辐照后代烟草材料小孢子培养技术进行研究。结果表明:不同基因型材料对游离小孢子培养的敏感性不同,所有的材料中产胚率最高的是(B0×柳烟)×云85组合,产胚率17.2;在材料4和材料6中随着秋水仙碱浓度的提高,两个材料的加倍率均增加,在浓度为100 mg/L时两个材料的加倍率最大。     

禾谷类花器官机械游离小孢子培养研究

以大田及温室生长的植株为材料,成功地建立了直接从禾谷类花器官(大麦穗切段、水稻颖花、小麦小穗)机械游离小孢子的程序及培养系统。从供试的二个大麦材料上重复获得大量游离小孢子再生植株,从一个水稻广亲和品种上得到游离小孢子再生植株,以及从三个小麦品种(系)上获得小孢子形成的多细胞结构(MCS)和早期胚状体(ELS)。相对较长时间的低温预处理有利于提高ELS(大麦)及MCS(小麦)的得率,改善培养物的通气状况,以及提早再分化有利绿色植株再生。     

结球甘蓝游离小孢子胚胎发生

以结球甘蓝品种“强夏”为材料进行游离小孢子培养,对与胚胎发生关系密切的因子进行探讨。研究结果表明,在盛花前期取材最适宜;单核晚期至双核期的小孢子才能发育成胚状体;含17%蔗糖的培养液在培养初期有利于小孢子存活;培养3d后胚胎诱导则以14％蔗糖浓度为最好;高浓度（17％）蔗糖培养3d后添加低浓度（11％）蔗糖培养液能大大提高胚胎发生能力,比一直在14％蔗糖培养液培养的提高282．4％,比更新培养液培养的提高126．1％。